‘红阳’猕猴桃叶盘高频直接再生体系的建立

以‘红阳’猕猴桃雌株幼叶为外植体,直接诱导产生不定芽,并对不定芽增殖以及生根体系进行优化,建立了高频再生体系。结果表明,在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA培养基中,不定芽诱导率达100％,平均出芽数达18.67个/叶盘;在MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培养基中,增殖率达100％,1~6代不定芽平均繁殖系数达8.63;不定芽在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培养基中培养15 d,然后继代至含1/2 MS液体培养基的珍珠岩中培养15 d,生根率达100％,且其根系发育良好;98株试管苗移栽到土壤盆钵中,成活95株,成活率达96.94％。本试验成功建立了红阳猕猴桃叶片高频直接再生体系,该体系诱导产生不定芽周期短,出芽率高,不定芽增殖系数大,生根率高且根系发达,为红阳猕猴桃试管苗的工厂化生产和遗传转化奠定了基础。     

利用YADE法进行棉花基因组PCR步行

设计了一种依靠“Y”形接头延伸未知序列的方法（YADE,Y-shaped Adaptor Dependant Extension）,成功地抑制了在未知序列圹增中的单引物扩增。用这种方法从棉花基因组中扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F027的相邻序列--FP27S和FP27A。重叠分析表明,F027S与F027有104bp的重叠,FP27A与F027有175bp的重叠。两个延伸片段分别含有1和3个可能的内含子,内含子均具有保守的边界序列GT-AG和与哺乳动物类似的分枝点序列。还对YADE法扩增未知序列的优缺点和可能的改进作了进一步讨论。     

一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法

为了鉴定携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株,以烟草核基因组上已知的单拷贝内源基因（RNR2）为内参,转基因烟草植株基因组DNA为模板,在同一PCR反应体系中扩增内源基因（RNR2）和外源目的基因（NPTⅡ）。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,获得了预期大小的两条特异性扩增条带。经ImageJ软件捕捉分析两条目的条带的灰度比,当T1代转基因烟草植株中外源基因与内源基因的扩增条带灰度比为1时,所检测植株即为单拷贝外源基因的转基因烟草植株。孟德尔经典遗传学方法证实了上述检测结果高度可信。     

毛白杨二次遗传转化体系的建立

为了建立有效的毛白杨二次遗传转化体系,优化了培养基激素配比、抗生素筛选浓度和乙酰丁香酮浓度.采用卡那霉素和潮霉素筛选,GUS组织染色和基因组DNA的PCR检测,通过二次遗传转化将GUS基因和潮霉素磷酸转移酶基因Hpt导入到毛白杨中,获得了60.7%二次转化频率.     

棉花类LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表达分析

从棉花胚株的cDNA－AFLP片段中,选取一个与拟南芥类LRR抗病原因（LRR－RL）序列相似的片段,用RACE方法延伸其3′和5′未知序列,得到一个棉花类LRR抗病蛋白的全长cDNA序列（GenBank登录号：AY040532）。该cDNA长1259bp,包含一个987bp的开放阅读框,具有Poly（A）加尾信号。推测蛋白质包含329个氨基酸,其中大部分是LRR区,其序列符合膜外LRR的共有序列LXXLXXLXXLXLXXNXGXIPXX。序列和结构比例分析表明：该棉花LRR－RL蛋白与拟南芥的两个类LRR抗病蛋白高度同源,而与植物的其他LRR蛋白结构不同,推测LRR－RL蛋白属于一类新的LRR蛋白。斑点杂交和3′RACE扩增表明,棉花LRR－RL基因具有组成性表达的特点。     

棉花Lea蛋白D-113基因启动子的克隆及序列分析

为研究植物Lea(late embryogenesis abundant）蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,通过PCR扩增,从棉花（Gossypium hirsutum cv.Coker312）中克隆了Lea蛋白基因家庭中D-113基因上游1024bp的调控序列。DNA序列分析结果表明,该片段与已报道的Lea蛋白基因同一家庭该基因的对应序列同源性达90%以上。将将启动子序列与GUS基因融合,构建成表达载体后,通过基因抢轰击导入到经ABA诱导处理的棉花胚性愈伤组织和油菜种子以及棉花的根、茎、叶中,组织化学分析结果表明,D-113基因启动子在胚中特异性表达。     

超量表达IPT和KN1基因对转基因烟草生长发育的影响

为了比较异戊烯转移酶基因IPT和玉米homeobox基因KNI超量表达对植物生长发育的影响,将35S：：IPT和35S：：KNI分别导入烟草。观察发现,过量表达IPT和KNI基因对植株再生频率、形态、生长周期和顶端优势等方面的影响均相似,但在生根和开花结籽方面,35S：：IPT转基因植物所受影响更显著。细胞分裂素含量检测表明,35S：：IPT转基因植物叶片中细胞分裂素的含量高于35S：：KNI转基因植物。     

利用Y-RACE法进行棉花胚珠cDNA末端快速扩增

在YADE(Y shapedadaptordependentextension)方法的基础上 ,设计了一种新的cDNA末端快速扩增方法 ,称为Y RACE法 .利用该方法只需一次cDNA合成就能进行多个基因的 3′和 5′末端的扩增 .分别利用Y RACE方法和RACE试剂盒 (TaKaRa)扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的末端序列 .序列比较表明 ,用Y RACE方法扩增的末端序列较试剂盒所得序列在最末端稍短 ,但同样能进行正确拼接并获得全长编码序列 .对Y RACE法的优缺点和可能的改进作了进一步讨论 .     

棉花PTS2受体基因(GhPex7)的克隆及表达分析

利用cDNA—AFLP差异片段F010,通过RACE延伸、EST、检索等方法获得了一个棉花过氧化物酶体定位信号2受体蛋白基因(peroxisomal targetingsignal type 2 receptor,GhPex7p)的编码序列。该cDNA包含一个954bp的开放阅读框,编码317个氨基酸,推测其等电点为5．603。同源性分析表明：推测GhPex7与拟南芥、酵母、果蝇、小鼠和人的Pex7p基因存在序列相似性,其中与拟南芥的同源性最高,为83％,并具有3段WD-40蛋白家族的保守域,与拟南芥AtPex7的编码蛋白同类。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。Northern blotting和RT-PCR分析表明该基因在棉花根、茎、叶、花、胚珠和纤维中均表达,但茎、叶组织中的表达水平明显高于胚珠和纤维。     

农杆菌介导LJAMP2基因导入‘红阳’猕猴桃及分子鉴定

为了获得抗溃疡病的‘红阳’猕猴桃转基因植株,以红阳猕猴桃试管苗叶盘为转基因受体材料,通过根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的LJAMP2基因导入红阳猕猴桃。450个叶盘与携带表达载体质粒pBI121的根癌农杆菌菌珠LBA4404共培养2 d后,转入含25 mg/L Kan的筛选培养基培养40 d,15 d转接1次,之后30 d继代1次。结果表明,在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA筛选培养基中,Kanr芽率达85%以上,在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培养基中,Kanr芽生根率达100%。共获得Kanr再生植株40株,经GUS组织染色和PCR分析证明,其中23株为转基因植株。阳性率为57.50%,转化率达5.11%。抗溃疡病基因LJAMP2已成功导入红阳猕猴桃,为红阳猕猴桃的抗病基因工程育种奠定了基础。