微卫星标记的制备策略

微卫星标记作为一类重要的、成熟的分子遗传标记,凭借自身的高变异性、孟德尔遗传模 式、共显性遗传方式等优点,在遗传及其它相关领域发挥了十分重要的作用,而其主要的缺点是 必须知道所研究生物的微卫星序列及其旁侧序列。随着人类及模式生物基因组的深入研究,微 卫星标记的制备经历了从费时、费力、低效的传统法到周期短、效率高的富集法(选择性杂交法和 FIASCO法);从基因组构建文库筛选到公共数据库ESTs发掘;从实验室自制到花钱购买。总之, 随着方法与技术的不断改进,从目标生物中获得微卫星标记变得越来越简单、经济。     

鲤春病毒糖蛋白(G)基因的分离及同源性比较

通过RT-PCR和巢氏PCR方法从疑似鲤春病毒(SVCV)侵染的镜鲤肝组织中获得了鲤春病毒糖蛋白(G)基因。通过序列测定与分析,所获得的鲤春病毒糖蛋白(G)基因由606个核苷酸组成,编码一个由202个氨基酸组成的糖蛋白。通过NCBIblast与9个来自不同国家或地区的鲤春病毒糖蛋白(G)基因序列比对分析,发现获得的鲤鱼春季病毒糖蛋白G基因DNA序列与美国分离的AY527273株同源性最高为99.8%,与中国分离的AY842485株同源性次高为98.7%,与英国分离的两个序列SVI538065和SVI538066株的同源性为98.2%,而与其它国家的分离株如SVU18101、SVI318079、SVI538061、SVI538062、SVI538063的同源性最差,仅为89.4%~90.0%。氨基酸同源性分析结果与DNA同源性分析结果一致,所获得的鲤春病毒糖蛋白G基因氨基酸推导序列与其它9个分离株的氨基酸同源性在89.6%~99.5%之间。对SVCV不同分离株遗传变异和进化关系的分析为下一步开展SVCV快速诊断方法的研究和疫苗的研制奠定了基础。     

鲫鱼Hind Ⅲ高重复DNA序列的分子克隆

基因组DNA高重复序列的研究有助于解释许多重要的生命现象 ,如基因调节、基因转座、基因进化等 ,还可以用于进行种群的遗传分析。鱼类的DNA高重复序列研究资料较少 ,曾在鲤科鱼类发现HindⅢ高重复序列家族。本研究用HindⅢ内切酶消化 ,从鲫鱼 (Carassiusauratusauratus)基因组DNA也克隆出一种独特的高重复序列。序列测定揭示该重复序列长度为 175bp ,在单倍体基因组的拷贝数为 1× 10 5。鲫鱼HindⅢ高重复序列与鲫鱼属 (Carassius)其它同类已知的高重复序列存在某种程度的变异 ,而与鲤科其它属的已知的HindⅢ高重复序列完全不同     

Tgf2转座子多克隆位点的克隆与表达

以金鱼pTgf2-EF1α-EGFP转座子为基础,构建含有多克隆位点(Multiple cloning sites,MCS)序列以及外源目的基因肌醇-3-磷酸合成酶(Myo-inositol-3-phosphate synthase,MIPS)的重组表达载体并注射到斑马鱼1-2期受精卵,检测重组表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP和pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP在斑马鱼中绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达情况以及外源基因MIPS在斑马鱼体内的整合情况。荧光观察结果显示,两个重组载体均不影响EGFP的表达,只是表达强度存在一定差异,表明对Tgf2转座子的改造是有效的。转基因斑马鱼PCR检测结果显示,靶基因MIPS的编码区能够完整地整合到斑马鱼基因组中,整合效率达31.4%。重组表达载体的成功构建显示金鱼Tgf2转座子可以介导外源基因在斑马鱼中的表达,为以后Tgf2转座子在鱼类基因功能研究方面奠定了基础。     

雌核发育银鲫子代中微卫星特异序列分析

雌核发育个体的基因型基本上完全与母本相同,这是源于卵子发生过程中没有经过减数分裂.父本的遗传物质是在随机水平、亚基因组水平或基因组水平参与到子代的遗传重组过程,从而对长期突变积累的雌核发育生物基因组进行补偿,一直是遗传学家关注的问题.本文对雌核发育银鲫特异个体及父母本5个微卫星位点的扩增条带进行了克隆测序,相似性比对结果显示,特异个体所表现的父咎匾霥NA条带,序列结果与父本完全相同或相似(SCM4、SCM9、YJ5),并在某些位点上保留了母本的特异条带(YJ5),而个体本身特异的DNA条带与父母本的相似性均较高(SCM13).同时,所检测到的个体经越冬后查验为雌性个体,进一步进行同源繁育,研究变异条带在繁殖中的命运.连续2代的繁育检测结果表明,融合了父本特异性条带的银鲫个体在繁殖过程中仍行雌核发育的生殖方式,变异来的条带能够传递给子代,进一步证实同源雌核发育银鲫通过小概率两性融合事件丰富银鲫种群的遗传多样性[动物学报 53(3):537-544,2007].     

大黄鱼耐低温性状相关微卫星标记的筛选

鱼类的耐低温性状是一种重要的经济性状。为了初步分析大黄鱼的耐低温性状,文章采用15对荧光微卫星标记,以SSR-PCR方法对大黄鱼低温耐受组和正常对照组F1代共40个个体进行了耐低温性状遗传差异分析。结果显示,标记LYC0002在两组样品中共扩增出5个等位基因(片段大小分别为112bp、110bp、108bp、106bp和104bp),其中LYC0002112bp等位基因在低温耐受组的出现频率达60%,而在正常对照组中的频率为零,表明该等位基因对大黄鱼的温度敏感特性有较明显的偏好性,可能与某种耐低温基因存在一定的连锁关系。此外,对LYC0002106bp、LYC0002108bp、LYC0002110bp和LYC0002112bp4个等位基因分别进行了回收、克隆及测序。序列比对结果显示,LYC0002112bp等位基因含有10个(CA)重复单元,而其他3个等位基因依次缺失1个(CA)重复单元,说明LYC0002在本研究样本中的突变方式为微卫星逐步突变模型(Stepwise mutation model,SMM)。     

借助斑马鱼EST数据库从鲤鱼微卫星序列中寻找蛋白编码基因

应用in sifico的方法,利用Blastu和Blastx搜索引擎,将鲤鱼微卫星序列与GenBank数据库进行同源序列比对.利用Blastn,将侧翼序列长度＞50bp的875个鲤鱼微卫星序列与斑马鱼的EST数据库首先进行比对,结果找到了121个同源序列.随后采用Blastx搜索蛋白质数据库,有94个微卫星位点存在同源蛋白.除了33个假定和3个未知蛋白外,剩余的58个微卫星位点被成功地进行了功能注释,而且其中的7个位点已经定位在了鲤鱼连锁图谱上.另外,通过PCR-SSCP的方法,将两个与鲤鱼微卫星侧翼序列相匹配的斑马鱼EST序列开发成鲤鱼的STS标记,并将其中的一个标记HLJZe33定位到鲤鱼连锁图谱上.以上研究结果表明,通过比较基因组研究,模式生物斑马鱼的很多遗传和基因组资源都可以被利用到鲤鱼的基因组研究中.     

双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。     

转大麻哈鱼生长激素基因鲤生态安全性检测与分析

评价了转大麻哈鱼（Oncorhynchus Suckley）生长激素基因鲤生态安全性问题及研究转基因鱼对天然野生鲤群体遗传污染程度。通过RAPD和SSLP方法,用265个RAPD标记和35对鲤的微卫星标记对受杂交鲤污染的哈尔滨江段黑龙江鲤群体、未受污染的抚远江段黑龙江鲤群体及模拟转基因鲤占普通鲤群体的1%和10%比例获得繁殖子代等实验群体的DNA样本进行全基因组扫描统计分析得出结论,即转基因鲤占普通鲤群体1%时对普通群体的基因污染程度是微乎其微的,远远低于杂交鲤对野生群体基因污染,转基因鲤占普通鲤群体10%时对普通鲤遗传背景的影响稍有升高,但仍然远远低于杂交鲤对野生群体基因污染程度。总之,在现有的检测技术条件及有效的监控条件下,与杂交鲤相比转基因鲤对鲤野生群体的遗传背景的影响是微弱的,而外来种和杂交种则对生态环境有严重威胁。     

细菌侵染的两种鲤鱼病生理反应及抗病性分析

通过人工接种嗜水气单胞菌(A.hydrophila)对受到细菌侵染的鲤鱼两个品种松浦鲤和德国镜鲤的病生理进行检测和分析,并采用DDRT-PCR方法对两种鲤的明显的抗感病个体基因差异进行初步分析。对血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)记数,尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、血糖(GLU)等生理生化指标进行了检测。人工接种试验表明,松浦鲤具有较强的抗病性,而德国镜鲤抗病性很差而感病性很强。DDRT-PCR结果表明,抗性基因在不同的鲤鱼群体之间及同种鲤鱼群体的不同抗感病个体之间表达水平不同。生理生化指标的变化反映出这两种鲤的抗性差异,在外来致病菌的刺激下,实验鲤体内的生理生化水平发生了变化,其中一些生化指标如谷丙转氨酶和总蛋白大幅度下降,其它生理指标表现出上升的趋势。总之松浦鲤在面对致病菌的侵染时从表型到生理生化水平上均表现出较强的抗病性。