蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达

蛇毒类凝血酶是临床上防治血栓栓塞性疾病的有效药物。参照朝鲜蝮蛇(Agkistrodon caliginosus,Korean Viper)类凝血酶calobin基因序列(GenBank AccessionNo.U32937.1),将人工合成的calobin基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,于毕赤酵母中表达,得到了分子量约为32kD的重组calobin蛋白,经甲醇诱导培养,表达产物可获得3.5g/L的高表达量。重组蛋白经过阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow和分子筛Sephacryl-S-100凝胶过滤层析等纯化步骤进行了初步纯化。纯化后的重组calobin可以在纤维蛋白原平板上形成水解圈,经SDS-PAGE实验显示,重组蛋白能水解纤维蛋白原的Aα链,产生一条约40kD左右的降解带。在实验中未能发现重组calobin对纤维蛋白原的凝固作用。     

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

转化生长因子β的生物学特性、功能及其临床应用前景

转化生长因子β是一种高度多效性,多功能性的生长与分化因子,它广泛地调节机体的生长,发育,炎症,修复和免疫等许多生理和病理过程,具有重要的生物学功能和广阔的临床应用前景。     

鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏茵标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUCl9,并对其进行测序,序列与献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUCl9的菌株生长情况更好。为完善染色体／质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。     

阿片受体的研究进展

阿片及其衍生物在神经系统中具有很强的镇痛作用,对阿片受体的研究已有20多年的历史。20世纪70年代发现了阿片受体的存在并先后发现了脑啡肽、β-内啡肽和强啡肽等阿片肽,随后发现了孤啡肽。如年代3种阿片受体的基因均已克隆成功,氨基酸序列表明它们均属G蛋白偶联受体,为7螺旋跨膜受体家族的成员,具有很高的同源性,功能包括介导腺苷酸环化酶的抑制作用以及一些离子通道的激活和抑制作用等。阿片受体基因的克隆将有利于新型临床药物的开发以及耐受和药物成瘾性分子基础的研究。目前阿片受体基因敲除、计算机结构模拟分析以及寻找新型阿片受体基因的研究均在深入进行。     

浅谈美国对生物工程的管理

生物技术是一项切实可行的技术,它已在基础研究、工业和商业的许多方面得到了广泛的应用,因此,不同部门之间的协调管理实属必要。1986年,美国政府在生物工程领域的协调大纲(Coordinated Framework)的出台标志着管理政策的开始。 协调大纲是一项广泛而复杂的协调政策,它解释了现存的对生物工程管理政策的使用,也阐述了各部     

人胸腺素α原cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程方法制取人胸腺素α原获得成功。用２０ｕｇ／ｍｌ植物血球凝集素（ＰＨＡ）和５００Ｕ／ｍｌ重组人白细胞介素２（ＩＬ－２）联合刺激人胎儿胸腺细胞,从中提取总ＲＮＡ,经反转录ＰＣＲ获得了人胸腺素α原ｃＤＮＡ;将之克隆入ｐＵＣ１９中,序列测定表明与已报道序列一致,进一步将之亚克隆入原核表达载体ｐＢＶ２２０,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ．观察到在不改变氨基酸编码的前提下,增加胸腺素ａ原上游引物中Ａ、Ｔ含量,可以明显提高胸腺素α原的表达量,同时,不同培养基对它的表达也有影响。胸腺素α原在大肠杆菌中以可溶形式表达,不需复性。初步活性测定显示,它可明显刺激人外周血淋巴细胞Ｅ－玫瑰花结形成率。重组人胸腺素α原在大肠杆菌中表达,为其临床应用及基础研究奠定了基础。     

CS3抗原基因的表达及纤毛装配元件的研究

在肠毒素大肠杆菌(ETEC)的已知定居因子中,CS3是临床分离株中最常见的抗原之一。为了研究CS3纤毛装配的基本元件,绘制了CS3亚基结构基因和辅助蛋白编码区的限制酶谱。通过亚克隆的亚基基因和不同辅助蛋白基因之间的互补性表达结果,确定了CS3纤毛装配所需要的辅助蛋白的DNA功能片段。微细胞分析结果显示,CS3基因的有效表达和纤毛装配至少需要6条蛋白多肽,分子量分别为(×10~3)15、17、24、27、48和90。除了15×10~3/17×10~3的蛋白多肽为CS3亚基外,其余的蛋白多肽参与CS3亚基的转运及纤毛的装配。根据以上结果初步确定了上述相关基因的相对位置。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的策略

基因打靶技术是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段,与小鼠胚胎干细胞培养系统相结合,使得人们可以方便地将各种突变引入小鼠体内,得以从生物整体水平上研究高等真核生物基因的表达、调控及其生理功能.扼要介绍了近年来在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的研究进展.