低能N+辐照拟南芥诱导基因组DNA碱基变异分析

用低能N+离子束注入拟南芥后获得的稳定突变体T80Ⅱ作为实验材料, 对突变体植株进行了RAPD标记, 并将T80Ⅱ和对照部分RAPD特异条带进行克隆测序和DNA序列分析. 结果显示, 在可分辨的总计397个RAPD条带中, T80Ⅱ株系中有52个条带表现出差异, 包括条带的缺失和增加, 条带变异率为13.1%; 克隆的T80Ⅱ序列中, 平均每16.8个碱基出现1个碱基变异位点, 表现出较高频率的碱基突变. 碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入等. 在检测到的275个碱基突变中, 主要是单碱基置换(97.09%), 碱基缺失或者插入的比例较小(2.91%). 在碱基置换中, 转换的频率(66.55%)高于颠换的频率(30.55%). 此外, 构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异, 而且每一种碱基都可以被其他3种碱基所替换, 但是胸腺嘧啶(T)的辐射敏感性要高于其他3种碱基. 通过分析突变碱基周边序列, 对低能N+离子注入拟南芥突变体引发的碱基突变热点进行了讨论.     

离子注入诱变莲花突变体分子机理的初步研究

低能离子注入技术作为生物物理诱变的一种新型技术, 在园艺植物育种方面具有很大的应用潜力, 但其诱变的分子机理目前知之甚少。文章对Fe+ 离子注入诱变的白洋淀红莲(Nelumbium speciosum Willd)突变体及其对照的基因组进行RAPD研究, 并将突变体和对照在辐射敏感位点的条带进行克隆测序及DNA序列分析。在已优化好的RAPD体系下扩增, 从110条随机引物中筛选出了10条可以稳定扩增出显著特异条带的引物, 引物多态性为9.09%。将这10条引物扩增出的辐射敏感位点的条带进行克隆测序, 并进行序列比对。结果显示: 突变体的总碱基突变频率为0.87%, 6个突变体的碱基突变频率存在着差异; 碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入, 在检测到的159个碱基突变中, 单碱基置换的频率(61.01%)高于碱基插入或者缺失的频率(38.99%), 在碱基置换中, 转换的频率(44.65%)是颠换频率(16.35%)的2.7倍, 其中C/T之间的转换所占比例最大, A→G和A→T也具有较高的替换频率; 构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱变发生变异, 除了没有C→G的置换外, 每一种碱基都可以被其他的几种碱基所置换, 但是胸腺嘧啶(T)具有较高的辐射敏感性。通过对碱基突变位点周边序列的分析发现, 嘌呤突变位点的周围嘌呤碱居多, 嘧啶突变位点的周围嘧啶碱居多。研究结果为揭示低能离子注入诱变作用分子机理提供了依据。     

氟氏链霉菌离子束注入突变谱的分析

用低能N⁺离子束注入转谷氨酰胺酶产生菌氟氏链霉菌后,通过试验,初步确定了注入的效应曲线,获得了一系列突变菌株。提取原始菌株和突变菌株的DNA,采用PCR反应分段扩增出转谷氨酰胺酶基因进行单链构象多态性分析(SSCP),并将特异性条带克隆测序进行基因突变型的鉴定,分析离子束注入引起链霉菌基因的基因突变类型及特点。结果显示:碱基变异的类型包括转换、颠换和缺失。在检测到的24个碱基突变中,主要是碱基的置换(87.5%),碱基缺失的比例比较小(12.5%)。在碱基置换中,转换的频率(58.3%)高于颠换的频率(29.2%)。转换主要以C→T,A→G为主,颠换以G→T,C→G为主。此外构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异,其中胞嘧啶发生突变的频率较高。     

γ射线诱导质粒pGEM-3Zf(-)DNA lacZ基因突变的序列分析

利用质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）ＤＮＡ上带有的ｌａｃＺ基因,通过Ｘ－ｇａｌ显色平板筛选经＾６０Ｃｏγ辐射诱导形成的突变体。对４个突变体的ｌａｃＺ基因进行序列分析发现,所有突变体无一例外地检测到碱基变化。在被测序的４８９ｂｐ范围内,一个突变体发生的碱基变异达２－７个位点。碱基变异的类型包括颠换（５７％）、转换（１９％）、缺失（１９％）及插入（５％）。在碱基置换中,以Ｃ／Ｇ→Ａ／Ｔ颠换最多（占５０％）。     

都柳江南方白甲鱼群体mtDNA D-loop序列及遗传多样性分析

为探究都柳江流域南方白甲鱼种群种质资源现状。本研究以采集自都柳江的40尾南方白甲鱼个体为实验样本,使用mtDNA D-loop分子标记技术,得到了长度近700 bp的南方白甲鱼D-loop序列。经分析序列中碱基A、T的含量高于碱基C、G,识别了序列的保守序列区、终止序列区和中央保守区以及相关的核心序列。都柳江南方白甲鱼群体D-loop序列有变异点13个,变异类型包括缺失、插入、转换和颠换。多态位点11个,其中单突变点和简约信息点分别有3个和8个。碱基转换颠换比为4.5∶1,变异尚未达饱和。确定了15个单倍体型。都柳江南方白甲鱼群体D-loop序列单倍型多样性度和核苷酸多样性指数分别为0.877 7和0.003 3。都柳江南方白甲鱼群体近期可能存在扩张现象,但其核苷酸多样性较低,需要开展其种质资源研究和保护。本研究从分子水平上为都柳江南方白甲鱼种质资源的评价、开发和利用提供基础。     

SNPs及其在水产动物遗传学与育种学研究中的应用

1 SNP简介1.1 SNP的概念单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)指基因组DNA序列中某个特定位点的单个核苷酸发生变异而引起的序列多态性,包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式,其中一种等位基因在群体中的频     

烟草航天诱变突变体变异检测及分析北大核心CSCD

为预测控制烟草重要性状的关键基因并研究航天诱变机理,对经航天诱变选育的烟草突变体材料NC89-M与野生型NC89进行全基因组重测序,测序深度30×,并对各种类型变异进行检测注释。NC89中检测到单核苷酸多态性位点(SNP,Single nucleotide polymorphism)1848013个,小片段插入缺失(Indel,insertion-delection)398922个,结构变异(SV,Structure variation)41969个;NC89-M中检测到SNP 1876219个,Indel 402011个,SV 42699个。NC89-M和NC89对比共得到271655个SNP,分布在8378个基因上,23450个Indel造成2156个基因突变。分析结果表明,NC89-M中SNP变异数目最多,其转换类型和颠换类型的比值为2.053,说明航天诱变对烟草基因组的变异以单碱基突变为主,突变类型以转换为主;在Indel中,插入突变数目明显多于缺失突变,证明航天诱变造成的Indel中以插入突变为主;在SV中,航天诱变主要造成了插入、缺失、倒位、染色体内部迁移和染色体间的迁移5种结构变异类型;变异基因KEGG注释表明,与代谢通路和次生代谢产物合成两方面基因突变数目最多;变异基因功能注释表明,突变体中调控开花时间的MADS-box基因,调控侧生器官发育与叶缘形状的KNOX1基因和萜类化合物合成相关基因等发生了变异。     

拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析

根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物,采用PCR产物双向测序法,克隆了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因部分序列(761 bp),并筛选、分析了拟穴青蟹的SNPs位点.共分析了采自福建省宁德市的16只拟穴青蟹,另外,从GenBank数据库中下载了31条前人提交的拟穴青蟹COI基因序列(长度在425-522 bp之间).利用MEGA 4.0软件对所有序列进行比对分析,结果表明碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.6％、17.8％、28.9％和15.7％,G+C的含量平均为33.5％.分析结果表明,在所克隆的761bp的COI基因序列中共发现29个SNPs位点,其出现频率为3.8％.在这29个SNPs位点中,13个为C/T转换(占44.8％),12个为A/G转换(占41.4％),2个为A/T颠换(占6.90％),1个为G/C颠换(占3.45％),另有一个位点(201 bp处)发生了A/C颠换和C/T转换两种类型的碱基替换.氨基酸分析表明,在29个SNPs位点中,有9个位点属于非同义突变,引起了氨基酸的变化;其他20个位点属于同义突变,未引起氨基酸的变化.这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记.     

烟草航天诱变突变体变异检测及分析

为预测控制烟草重要性状的关键基因并研究航天诱变机理,对经航天诱变选育的烟草突变体材料NC89-M与野生型NC89进行全基因组重测序,测序深度30×,并对各种类型变异进行检测注释。NC89中检测到单核苷酸多态性位点(SNP,Single nucleotide polymorphism)1848013个,小片段插入缺失(Indel,insertion-delection)398922个,结构变异(SV,Structure variation)41969个;NC89-M中检测到SNP 1876219个,Indel 402011个,SV 42699个。NC89-M和NC89对比共得到271655个SNP,分布在8378个基因上,23450个Indel造成2156个基因突变。分析结果表明,NC89-M中SNP变异数目最多,其转换类型和颠换类型的比值为2.053,说明航天诱变对烟草基因组的变异以单碱基突变为主,突变类型以转换为主;在Indel中,插入突变数目明显多于缺失突变,证明航天诱变造成的Indel中以插入突变为主;在SV中,航天诱变主要造成了插入、缺失、倒位、染色体内部迁移和染色体间的迁移5种结构变异类型;变异基因KEGG注释表明,与代谢通路和次生代谢产物合成两方面基因突变数目最多;变异基因功能注释表明,突变体中调控开花时间的MADS-box基因,调控侧生器官发育与叶缘形状的KNOX1基因和萜类化合物合成相关基因等发生了变异。     

云南猕猴mtDNA控制区全序列测定

目的测定云南猕猴线粒体DNA控制区全序列,对其进行鉴定及进化分析。方法利用PCR技术扩增猕猴线粒体DNA控制区全序列,结合GenBank中下载的猕猴参考序列（AY612638）,采用多个生物学软件对序列碱基组成、同源性、转换／颠换比等遗传信息进行分析,并基于邻接法（NJ）和最小进化法（ME）构建系统进化树。结果云南猕猴线粒体DNA控制区全长为（1084-1089）bp,A、T、G和c四种碱基平均含量分别为29．9％、26．9％、12．3％和30．9％,A＋T含量（56．8％）高于G＋C含量（43．2％）。所分析序列间的同源性为91．5％-99．5％,平均核苷酸变异率为4．5％,变异类型包括转换、颠换、插入和缺失4种形式,转换／颠换比值平均为26．1。进化树显示云南猕猴存在两个平行进化的姐妹分支。结论本研究获得了云南猕猴mtDNA控制区全序列,为猕猴进化关系研究及mtDNA控制区功能研究奠定基础。     

两种鯻科鱼类线粒体16S rRNA基因片段序列分析

利用PCR技术成功扩增了高体革鯻(Scortum barcoo)和厚唇弱棘喇(Hephaestus fuliginosus)的线粒体16S rRNA基因序列.通过序列测定,得到791 bp的基因片段,碱基A、T、G、C平均含量分别为31.4％、21.2％、20.5％和26.9％,序列中的A+T含量明显高于G+C的含量,这与其他鱼类的16S rRNA基因片段研究结果相一致.通过序列分析发现,高体革鯻和厚唇弱棘喇两序列共存在23处碱基变异,其中碱基转换位点20个,碱基颠换位点3个,转换与颠换比率为6.7,没有发现碱基插入与缺失.与从GenBank中查到的3种蜊科鱼类的同源序列比对,邻接法(neighbor-joining)构建亲缘关系树,结果显示,5种蜊科鱼类聚在一起,分为独立的2支,匀蜊和单色匀鯻及花身蜊聚成1支,高体革鯻和厚唇弱棘鯻聚为1支,说明高体革鯻与厚唇弱棘蜊的亲缘关系比较近,而与其他另外3种鯻科鱼类亲缘关系比较远.     

利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1

植物多酚氧化酶具有多种重要的生理功能。为研究烟草中多酚氧化酶基因功能,从GenBank中挑选一个烟草多酚氧化酶基因(基因登录号为XM_016608009.1),命名为NtPPO1。NtPPO1编码序列经PCR扩增、克隆测序验证后,采用CRISPR/Cas9技术定点敲除NtPPO1,并利用实时荧光定量PCR检验基因敲除效果。研究表明烟草NtPPO1全长1 746 bp,存在2种可变剪切方式。经测序与分析发现,T2突变体中的NtPPO1序列在靶位点处发生了1个、2个碱基的缺失突变与1个碱基的插入突变。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照相比,T2突变体中NtPPO1表达水平显著下降。烟株外观显示NtPPO1突变体与野生型对照之间无明显差异。     

相邻碱基组分与产生SNP的转换或颠换在植物基因组中的研究

碱基替换突变是形成物种多态性和造成生物进化的根本原因之一. 近年的研究表明: 基因组的碱基组分在不同程度上与碱基替换突变的发生相关. 以水稻全基因组3611007个SNPs(包括45462个编码区SNPs和242811个内含子区SNPs)和拟南芥全基因组32019个SNPs为研究对象, 研究突变位点周围的碱基A&;T(A和T)的使用频率和点突变类型的相关性, 结果表明: 水稻和拟南芥全基因组上转换和颠换的比值(Ts/Tv)以及紧邻突变位点(上下游各1个碱基)上A&;T碱基的个数负相关. 统计了6种SNP的AT₂ (直接相邻的碱基是A或T的个数)和AT₀ (直接相邻碱基是C或G的个数), 发现水稻和拟南芥都是C/G型SNP的AT₂/AT₀值最大, 说明C/G型SNP可能受直接临近区域上A&;T碱基的影响最大. 在水稻全基因组SNPs中, A&;T碱基影响突变的范围局限在突变位点上下游2个碱基内. 拟南芥A&;T碱基影响其全基因组SNPs的范围不超过上下游4个碱基.     

西藏牦牛mtDNA D-loop区的遗传多样性及其遗传分化

通过测定和分析西藏11个牦牛类群114个个体的mtDNA D-loop区全序列,对西藏牦牛的遗传多样性、类群间的亲缘关系及其遗传分化进行了研究。结果表明:①西藏牦牛mtDNA D-loop区全序列长度为890—896 bp,4种核苷酸T、C、A、G的平均比例分别为28.5%、25.3%、32.4%、13.8%,西藏牦牛mtDNA D-loop区富含碱基A+T,表现出一定的碱基偏好性。②共检测到130个变异位点,占分析总位点数的14.33%;其中单一多态位点85个,占多态位点总数的65.38%,简约信息位点45个,占多态位点总数的34.62%。序列变异中碱基缺失、插入和碱基替换等均有,其中碱基替换变异类型中转换114次,颠换12次,在转换变异类型中以A/G、T/C为主,占95.61%,在颠换变异类型中以A/T为主,占75%。③在114个个体中鉴定出90种单倍型,单倍型多样性为0.981±0.008,核苷酸多样性为0.01056±0.00701,均说明西藏牦牛具有丰富的单倍型类型。④90种单倍型分为2个聚类簇(Ⅰ、Ⅱ),聚类簇Ⅰ包含80种单倍型,占全部单倍型的88.89%,涵盖本研究中所有的西藏牦牛类群;聚类簇Ⅱ中有10种单倍型,占单倍型总数的11.11%,涉及的类群有工布江达、帕里、丁青、巴青、江达、类乌齐、桑桑、桑日、斯布,说明西藏牦牛可能有2个母系起源。⑤西藏牦牛类群间核苷酸分歧度(Dxy)在0.503%—1.416%之间,聚类分析和AMOVA分析显示西藏牦牛可分为两大类,康布牦牛、嘉黎牦牛为一类,其余的牦牛类群为另一类。     

化学诱导激活型拟南芥突变体库的构建及分析

利用化学诱导激活XVE（LexA-VP16-ER）系统构建了一个包含40000余个独立转化株系的拟南芥突变体库,并对其中的18000余个株系进行了初步的遗传学和表型分析鉴定。卡那霉素抗性分离比表明,51．6％的株系为单位点插入株系,T-DNA插入的平均拷贝数为每株系1．38个。部分T1代和T2代植株表现出了可见的形态变异,包括下胚轴长度、根长度、植株大小和颜色、叶子颜色和形态、开花时间、种皮颜色及结实情况等对数个代表性突变株系表型及T—DNA插入位点侧翼序列进行了分析,结果表明突变体的表型是由于T—DNA的插入造成的,而且这些突变体中包括前人发现的AP2和AGAMOUS的等位基因。由于T-DNA标记或相邻的基因可被XVE系统诱导性的激活,或被T-DNA破坏导致功能缺失,该突变体库可以用于大规模筛选鉴定功能缺失性和功能获得性突变体。     

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)ast(anthocyanin spottedtesta)突变体是由碳离子辐射诱导产生的与花青苷生物合成有关的基因突变体,受单隐性核基因控制.根据拟南芥数据库中的SNPs(single nucleotide polv-mophisms)序列和插入/缺失多态性(insertion/deletion polymorphisms)序列,设计了一系列分子标记.采用图位克隆策略,应用这些分子标记完成了对拟南芥AST基因的精细作图,成功地将AST基因定位到BAC克隆T13M11上,初步认为该BAC克隆中的基因T13M11.8可能是AST基因.该基因的DNA序列长1432bp,含有6个外显子和5个内含子,编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶有较高的同源性.将进一步通过功能互补实验验证图位克隆的结果.     

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)ast(anthocyanin spotted testa)突变体是由碳离子辐射诱导产生的与花青苷生物合成有关的基因突变体。受单隐性核基因控制。根据拟南芥数据库中的SNPs(single nucleotide poly-mophisms)序列和插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphisms)序列,设计了一系列分子标记,采用图位克隆策略。应用这些分子标记完成了对拟南芥AST基因的精细作图,成功地将AST基因定位到BAC克隆T13M11上,初步认为该BAC克隆中的基因T13M11.8可能是AST基因。该基因的DNA序列长1432bp。含有6个外显子和5个内含子,编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶有较高的同源性。将进一步通过功能互补实验验证图位克隆的结果。     

中国西藏近缘野生大麦5S rDNA NTS序列分析

选取来自西藏不同地理区域的17份近缘野生大麦材料和1份国外的近缘野生大麦材料,利用直接PCR、T-载体转化克隆、克隆产物测序的方法获得了它们的5S核糖体DNANTS（Nontranscribed intergenic spacer）序列。对这些序列进行测定、分析和比较,构建了分子系统树。结果表明,西藏近缘野生大麦NTS序列包括两段相对保守的保守区A和保守区B以及一段变异较大的变异区V,变异区由若干个TAG碱基的重复序列构成。两段保守区总长度为168～169bp,长度变异较小,仅相差1bp。保守区的GC％含量为43．8％,其中有12个核甘酸位点发生变异（占总核甘酸数目的7．1％）,变异位点基本上是颠换多于转换,颠换／转换率为1．0～2．0。变异区中TAG重复序列的重复次数从4到17次,而且有部分TAG重复发生了颠换和转换（TAG→TCG,TAG→TAC）。TAG重复序列的多态性是决定NTS序列多态性的主要因素。对西藏近缘野生大麦和麦属其他作物的比较,认为rDNA NTS适合作为属内分类的分子标记。     

中国田鼠卵巢细胞gpt基因自发和亚砷酸钠诱发突变的分子分析

本文研究了亚砷酸钠对CHO-AS52细胞gpt基因的致突变作用。实验结果表明,亚砷酸钠能诱发该基因发生突变,且其突变频率随砷浓度的增加而增高。PCR分析指出,绝大多数亚砷酸钠诱发的CHO-AS52突变体的gpt基因完全缺失。在CHO-AS52细胞自发的、50μmol/L和100μmol/L亚砷酸钠诱发的突变体中,gpt基因完全缺失者所占比率分别为36.00％、54.72％及66.67％。对亚砷酸钠诱发的非缺失型gpt基因突变的PCR产物直接进行DNA序列分析表明,在9个突变细胞克隆中,有2个发生移码突变,其余7个突变细胞克隆的gpt基因结构未发现改变,碱基的改变可能发生在基因启动子区。     

我国登革3型病毒广西80-2株基因组全序列分析

对我国登革 3型病毒 80 2株基因组进行全序列测定 ,为了解其基因组结构与功能的关系提供依据 .根据登革 3型病毒H87株的序列设计并合成引物 ,应用RT PCR和RACE法 ,对 80 2株基因组RNA进行扩增、克隆测序后获得我国登革 3型病毒广西株基因组序列 .该株病毒基因组全长10 696nt ,不含poly(A)尾 ,4种碱基数分别为A :3 4 3 7,C :2 2 15,G :2 773 ,U :2 2 71.包含一个读码框架 ,自 95至 10 2 67位 ,共 10 170个碱基 ,编码 3 3 90个氨基酸 ,5′和 3′非编码区长度分别为 94nt和4 3 2nt.与H 87株比较 ,核苷酸和氨基酸序列同源性均在 99%以上 ,有 2 8个碱基发生改变 ,其中 2 6个碱基突变发生在读码框架内 ,碱基转换 18个 ,颠换 10个 ;碱基突变引起 14个氨基酸的改变 .80 2株与H87株病毒的基因组全序列同源性高 ,变异度小 .