一种新型的双功能体内突变检测系统的建立

将含有两个LacI靶基因的穿梭质粒pMCLacI/neo整合入小鼠的基因组中 ,建立一种能同时分析体内表达基因和沉默基因的双功能的新型体内突变检测系统 ,使在体内比较分析不同组织、器官中表达基因和沉默基因的突变谱和突变率成为可能。486个经显微注射过 pMCLacI/neo质粒的C5 7BL/ 6小鼠的受精卵 ,分别移植入 18只假孕母鼠的输卵管中 ,产下 32只存活小鼠 ,进一步检测证实 :(1)有 5只小鼠在基因组中整合有 pMCLacI/neo基因 ;(2 )该质粒中的两个LacI靶基因 ,只有一个表达 ;(3)能有效地从小鼠基因组中回收 pMCLacI/neo基因。因此 ,成功建立了pMCLacI/neo的转基因小鼠品系 ;可以将该小鼠用于整体动物水平研究表达基因和沉默基因突变机制的模型 ;该模型为一种具有双功能的新型体内突变检测系统     

高粱EMS诱变及突变体筛选、鉴定

突变率和突变类型是突变体表型筛选和构建饱和突变体库的重要依据。采用不同时间和不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)处理高粱品种BTx623的种子,突变率和突变类型差异较大。突变类型可分为叶色、叶形、穗型、育性及生育期等,变异类型较丰富。根据处理后种子出苗率、结实率和突变率的情况,最终确定20 h+EMS 0.2%为最佳的诱变处理时间和浓度。但构建饱和突变体库,建议采用多浓度多时间处理方式。     

绿玉树试管苗物理化学诱变及其抗寒突变体的筛选

以已建立的微体繁殖体系为基础,对绿玉树再生丛芽进行Co^60γ射线不同剂量的辐射和不同浓度EMS诱变处理,以HYP为突变体选择压,筛选出抗HYP突变体小苗,并对突变体小苗进行抗寒测试。结果表明：辐射剂量影响丛芽的增殖、突变率及芽苗的生长,1．5KR为绿玉树丛芽辐射诱变比较适宜的剂量。0．2％的EMS亦能诱导绿玉树丛芽块产生突变芽,但与正常培养获得的再生小苗相比,诱变后产生的抗HYP芽苗生长缓慢,再生小苗矮小。抗HYP突变小苗的抗寒性比正常植物的抗寒性强。     

重离子诱变枯草芽孢杆菌高产复合酶菌种的筛选

重离子诱变作为一种新型高效的辐照诱变方式,具有突变率高、突变谱广、突变体稳定等特点。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因具有多种水解酶活力而广泛应用于工业生产,虽然经过多次诱变和改造,其酶活力不断提高,但其复合酶活力仍有提升空间。同时,多次同种诱变剂的使用容易导致菌种产生"抗性",酶活力提高不大。为此,本研究首次利用不同剂量¹²C⁶⁺重离子束对枯草芽孢杆菌20076进行辐照诱变。诱变后通过透明圈初筛和酶活力验证复筛方式选育出一株复合酶活力较高的菌株B. subtilis KC-1。与原始菌株相比,其发酵液滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力、β-葡萄糖苷酶活力、外切葡聚糖酶活力、蛋白酶活力和α-淀粉酶活力分别提高了20. 2%、79. 6%、98. 2%、7. 4%、10. 4%和27. 4%。11代遗传稳定性实验结果表明该突变株具有良好的稳定性。     

梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变筛选模型的初步研究

本文通过梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 4 1 80菌株孢子对 6种抗生素敏感性测定 ,采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含致死浓度链霉素的高氏平板上。然后从抗药性突变标志菌株中进一步筛选梅岭霉素高产菌株。在 150 0多个抗药性突变株中通过初筛获得了比诱变出发菌株的产素能力提高 50 %以上菌株。通过诱变剂量分别与抗药性突变率和突变株产素产量的变势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产素突变密切相关 ,产素突变的EMS诱变剂量高于抗药性突变诱变剂量 ,在 0 .0 3mol/LEMS剂量作用下 ,菌株致死率为 99.4 3% ,抗药性突变率为 0 .0 4 4 0 % ,建立了梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变推理性筛选模型。为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试 ,并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

原生质体诱变选育乳糖酶高产菌株*

采用紫外线诱变和⁶⁰Co-γ射线协同诱变的方法,对出发菌株Uco-3的原生质体进行诱变处理,通过正突变率与诱变剂量的相互关系,确定最佳诱变剂量。采用4min的紫外线照射和剂量为500Gy的γ射线对黑曲霉Uco-3的原生质体进行诱变,获得一株产高温乳糖酶的高产突变株,突变株产乳糖酶能力显著提高,产酶活力达44.37U/mL,是出发菌株Uco-3的2.73倍。     

离子注入诱变莲花突变体分子机理的初步研究

低能离子注入技术作为生物物理诱变的一种新型技术, 在园艺植物育种方面具有很大的应用潜力, 但其诱变的分子机理目前知之甚少。文章对Fe+ 离子注入诱变的白洋淀红莲(Nelumbium speciosum Willd)突变体及其对照的基因组进行RAPD研究, 并将突变体和对照在辐射敏感位点的条带进行克隆测序及DNA序列分析。在已优化好的RAPD体系下扩增, 从110条随机引物中筛选出了10条可以稳定扩增出显著特异条带的引物, 引物多态性为9.09%。将这10条引物扩增出的辐射敏感位点的条带进行克隆测序, 并进行序列比对。结果显示: 突变体的总碱基突变频率为0.87%, 6个突变体的碱基突变频率存在着差异; 碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入, 在检测到的159个碱基突变中, 单碱基置换的频率(61.01%)高于碱基插入或者缺失的频率(38.99%), 在碱基置换中, 转换的频率(44.65%)是颠换频率(16.35%)的2.7倍, 其中C/T之间的转换所占比例最大, A→G和A→T也具有较高的替换频率; 构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱变发生变异, 除了没有C→G的置换外, 每一种碱基都可以被其他的几种碱基所置换, 但是胸腺嘧啶(T)具有较高的辐射敏感性。通过对碱基突变位点周边序列的分析发现, 嘌呤突变位点的周围嘌呤碱居多, 嘧啶突变位点的周围嘧啶碱居多。研究结果为揭示低能离子注入诱变作用分子机理提供了依据。     

乙酰基亚硝基脲诱导小鼠突变的初步研究

目的　探索乙酰基亚硝基脲 (ENU)诱导小鼠突变的效率 ,筛查并获得能显性遗传的突变型小鼠。方法　采用 8～ 10周龄的雄性C57BL 6小鼠 33只、DBA 2小鼠 18只 ,腹腔注射ENU10 0mg kg ,每周一次共三次 ,与同品系母鼠配种 ,在后代小鼠中针对可见表型筛查突变个体。结果　处理雄鼠有 9至 13周的不育期 ;在已经筛查的12 4 1只小鼠中得到眼睛异常、多趾、少趾及腹部白斑、矮小等突变个体 6 1只 ,突变率约 5 % ;获得单基因显性遗传的突变品系 2种。结论　ENU为小鼠的强诱突变剂 ;通过诱变可以得到遗传突变小鼠 ,为建立人类疾病动物模型提供条件 ;大规模诱变实验对小鼠功能基因组的研究有重要意义     

花生EMS诱变后代的农艺性状与品质分析

为了研究花生EMS诱变后代的变化趋势,以期得到有益变异和创造新的花生种质,本研究以2个花生品系花U416、花U606为供试诱变亲本,利用0(CK)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%5个EMS浓度直接注入花生花器得到诱变后代,分析M1、M2的农艺性状与品质变化,结果表明,EMS对2个花生品系诱变效应明显,2个品系畸变率随EMS浓度增加而增大;EMS注入的当代植株结实率和M1的出苗率均低于对照,2个品系M2均产生了多种类型的突变植株,突变性状大部分可以稳定遗传。而这些遗传多样性的突变材料,为花生种质创新及品种遗传改良提供基础性材料。     

La-tPA/G-CSF双转基因鼠的建立及在乳腺的表达研究

分别以小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′区 2 .6kb和羊β 乳球蛋白 (BLG)基因5′区 5kb为调控序列 ,构建了乳腺表达人集落剌激因子 (G -CSF)及组织纤溶酶原激活剂突变体 (La- tPA)载体 .利用显微注射法分别建立了G -CSF和La -tPA的转基因小鼠 ,在获得G -CSF和La -tPA表达基础上 ,采用 2种转基因小鼠交配的方式 ,对后代仔鼠进行了双引物同步PCR检测 ,筛选并建立了La- tPA和G -CSF的双转基因鼠 ,研究了不同转基因在小鼠体内共表达的情况 .Northernblot分析表明 ,在一些双转基因鼠中表达出La- tPA和G -CSF .后代鼠的一些基本特征为 ,产仔数明显低于正常鼠 ,双转基因占 46 .1 %,雌雄比例基本正常 .双转基因鼠的建立为未来利用转基因动物生产多种蛋白质提供依据 .     

人成体肝细胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝脏中的显著增殖

利用人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立人源化肝脏的嵌合体小鼠(人鼠嵌合肝)对药物代谢、乙型肝炎病毒等嗜肝性病毒及其疫苗的研究具有重要意义. 研究表明, 利用Fah^-/-Rag2^-/-Il2rg^-/-三基因剔除小鼠可获得人肝细胞在小鼠肝脏中的显著再殖, 但较高的死亡率及纯合子不能用于繁殖, 制约着该小鼠模型的规模化应用. 本研究结合延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因剔除(Fah^-/-)小鼠的肝脏再殖优势和Nod/Scid小鼠异种移植的特点, 将这两种小鼠进行杂交繁育建立Fah^-/-Nod/Scid小鼠品系, Fah^-/-Nod/Scid小鼠可以纯合保种并能正常繁殖. 采用提前停药的预处理方案, 结合FK506处理, 移植的人成体肝细胞能够实现在Fah^-/-Nod/Scid小鼠肝脏中的显著增殖, 肝脏再殖程度达到30%以上. 采用体重曲线、肝功能和人肝细胞功能蛋白表达等三方面指标评价嵌合肝脏中人肝细胞的功能, 结果表明再殖的肝细胞具有正常的人肝细胞功能. 这些结果表明, Fah^-/-Nod/Scid小鼠可以作为理想的可规模应用的人鼠嵌合肝模型, 该技术体系的改进简化了Fah^-/-小鼠作为人源化肝脏小鼠模型的实用性问题.     

华葵根瘤菌nifA基因的克隆和功能分析

华葵根瘤菌(Mesorhizobium huakuii即R.astragali)159的nifA基因的序列分析表明,该基因全长1227bp,编码分子量为44734D的Nif A蛋白。与其它NifA蛋白的序列比较发现,华葵根瘤菌NifA蛋白也存在保守的中间结构域和C末端DNA结合结构域,但其氨基端缺失。Tn5定点突变得到的突变体是Nif-表型。构建了nifA基因组成型表达的质粒,此质粒在大肠杆菌中对华葵根瘤菌nifHlacZ有激活作用。     

EMS诱变西瓜突变体库的构建及表型分析

采用1.0%诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理西瓜品系W1-17种子9h,然后对M1和M2代群体单株在叶、花、茎、育性、分支习性等方面进行表型变异观察,同时选取M2代典型变异株系,利用23对西瓜SSR引物进行分析鉴定,构建西瓜突变体库。结果表明:(1)EMS诱变使M1代幼苗形态呈现出叶畸形、叶褶皱、部分黄化、花畸形、雄花不散粉、卷须畸形、矮小、生长缓慢、不育等特异性状,获得由1 252个单株组成的西瓜突变体M1群体,群体总变异频率为18.33%。(2)M2代共筛选到205个突变植株,40种表型变异,表现在子叶性状(黄化、扭曲不对称、折叠等)、叶和茎性状(叶黄化、变小、裂刻变深,茎变细,节间变短,分支少等)、花性状(花变大,花色变浅,两性花,花瓣皱缩、部分退化、数目突变,柱头畸形,雄蕊不成熟等)和其他性状(生长缓慢、不育等)等方面,总的表型突变率达到了19.59%。(3)针对M2代10个典型变异植株,通过SSR引物分析发现有9份材料在DNA水平上有变异。本研究初步构建了含有120个M1代家系及1 051株M2代植株、40种表型变异的西瓜突变体库。     

拟南芥叶绿体分裂突变体pdl37的基因鉴定与分析

pd137是经甲基磺酸乙脂（ethyl methane sulphonate, EMS）诱变并通过筛选得到的一个拟南芥叶绿体分裂突变体。该突变体的叶绿体表型与野生型相比有很大差异： 叶绿体面积显著增大, 细胞中叶绿体数量明显减少。遗传分析显示pd137的突变表型受隐性单基因控制。本研究通过遗传作图将该突变基因粗定位于拟南芥2号染色体的分子标记CH2-13.70和CH2-16.0区间内。该区间内已知的与叶绿体分裂相关的基因只有FtsZ2-1。对FtsZ2-1基因的测序结果显示pd137突变体的FtsZ2-1基因第505位碱基发生了无义突变, 使蛋白质翻译提前终止。该突变还严重影响了FtsZ2-1基因的mRNA水平。转基因互补实验进一步验证了该突变体表型是由于FtsZ2-1基因突变引起。本项工作为研究叶绿体分裂的机制提供了新材料和一些有用的线索。     

拟南芥叶绿体分裂突变体pd137的基因鉴定与分析

pd137是经甲基磺酸乙脂(ethyl methane sulphonate,EMS)诱变并通过筛选得到的一个拟南芥叶绿体分裂突变体。该突变体的叶绿体表型与野生型相比有很大差异:叶绿体面积显著增大,细胞中叶绿体数量明显减少。遗传分析显示pd137的突变表型受隐性单基因控制。本研究通过遗传作图将该突变基因粗定位于拟南芥2号染色体的分子标记CH2-13.70和CH2-16.0区间内。该区间内已知的与叶绿体分裂相关的基因只有FtsZ2-1。对FtsZ2-1基因的测序结果显示pd137突变体的FtsZ2-1基因第505位碱基发生了无义突变,使蛋白质翻译提前终止。该突变还严重影响了FtsZ2-1基因的mRNA水平。转基因互补实验进一步验证了该突变体表型是由于FtsZ2-1基因突变引起。本项工作为研究叶绿体分裂的机制提供了新材料和一些有用的线索。     

粉被虫草N6-(2-羟乙基)腺苷高产菌株的原生质体诱变育种*

在粉被虫草(Cordyceps prainosa Petch)无性型——粉被马利娅霉(Mariannaeapruinosa Liang)原生质体形成和再生的前期研究基础上,报道了通过原生质体诱变培育高产N⁶-(2-羟乙基)腺苷菌株的研究结果。粉被马利娅霉Cp-14单孢子株经15W紫外灯照射后,获得一高产突变株MpM-135．经多代移植后,此突变株比出发菌株Cp-14的N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量提高了14.8％。实验还表明,粉被虫草无性型菌丝提取物对枯草杆菌(Bacillussubtilis)抗紫外辐射效果与菌丝所含N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量有正相关性。     

氮离子束注入诱变小麦的研究

和其他诱变方法相比较,低能氮离子束注入作为一种新的诱变方法具有生理损伤小、突变谱广和突变频率高等特点。据此利用该方法处理“遗4212”,建立起具有60个株系的突变群体。通过调查生育期、农艺性状、醇溶蛋白和微卫星的变异,对后代M4群体进行系统的研究。结果表明：群体的生育期和农艺性状变异明显,有7个ω-醇溶蛋白的迁移率变异并伴随着蛋白的缺失和增加;在25个SSR位点出现扩增产物的缺失、延长和缩短。结合实验结果和其他相关报道,讨论了实验所获得突变体的应用及离子束注入引发突变的机理。     

利用Tn5定位诱变筛选紫云英根瘤菌Exo-变种

利用Tn5定位诱变方法,对质粒Pjb-B5进行Tn5插入诱变,得到10个Tn5在5.9kbB5外源片段上有不同插入位点的质粒TN1-1,TN1-12,TN2-2,TN2-3,TN3-1,TN4-1,TN9-|1,TN10-1,TN13-1,TN14-1。将Tn1-1等分别转移到已经含有不相容质粒Pph1ji的紫云英根瘤菌107菌株中,使之发生同源变换。通过抗性选择及表型鉴别,筛选到3株菌落表型干燥(Muc^-)的酸性胞外多糖(EPS)合成缺陷菌株(Exo^-)107(TN2-2),107(TN10-1),107(TN13-1)\.Southern杂交分析证明这3株变种的Tn5插入确实是同源交换而不是转座产生,表明经过适当改良的Tn5定位诱变法可以应用于紫云英根瘤菌Exo-变种的筛选。     

导入TaNHX2基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性

我国部分地区土地盐碱化的日益严重,对作物的生长和生态环境产生了显著影响,因此通过植物基因工程手段培育耐盐碱的转基因作物品种对改善作物的生存能力和生态环境,提高作物产量具有重要的意义。采用农杆菌介导法将来自小麦(Triticum aestivum Linn)的Na⁺ /H⁺逆向转运蛋白的基因(vacuolar Na⁺/H⁺ exchanger or antiporter,简称NHX、NHE或NHA),对普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)植株进行了遗传转化。经抗生素筛选以及针对TaNHX2基因的PCR检测和Southern杂交分析,证明获得了28株转TaNHX2基因的普那菊苣植株。用不同浓度NaCl溶液对普那菊苣野生型和T₀代种子、愈伤组织和幼苗生长情况胁迫的研究,结果表明:转TaNHX2基因普那菊苣植株表现出一定的抗性,比野生型明显提高。在300 mmol/L NaCl胁迫下转基因植株种子的出芽率、外植体出愈率和分化率是野生型植株的2-4倍,而500 mmol/L NaCl浓度为野生型和转基因外植体能否生长的临界点。在此临界值下野生型外植体或不能形成愈伤组织、或幼苗不能正常生根、或已生根幼苗不能正常成长,而转基因外植体可以继续形成愈伤组织并正常生根生长。同时对500 mmol/L NaCl胁迫下野生型和转基因普那菊苣幼苗其体内丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定,结果表明 转基因植株比野生型植株的MDA含量降低了1-3倍,POD活性提高了1-3倍,SOD活性提高了2-3倍,分析发现普那菊苣的耐盐性与其体内的丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性密切相关。