我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .     

急性弛缓性麻痹病例中Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒变异株基因特征分析

研究Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗变异株的基因特征,为我国使用口服脊灰减毒活疫苗/脊灰灭活疫苗使用策略,维持无脊灰状态和全球最终消灭脊灰提供科学依据。根据型内鉴定的检测结果,从2000~2001年AFP病例分离到的Ⅱ型脊灰疫苗变异株中选取有聚集性的5株病毒进行全基因组序列测定(贵州省3株、山东省2株),并进行核苷酸、氨基酸同源性分析。贵州省3株病毒全基因组序列完全一致,但与SabinⅢ型病毒发生重组,重组区域在3A区(nt5343~5353);与疫苗株相比,Ⅱ型区域变异10个碱基,其中VP1区变异4个,与SabinⅡ型株核苷酸同源性为99·56%,氨基酸同源性99·34%;Ⅲ型区域变异9个碱基。山东省2株病毒全基因序列共享16个突变位点,没有发生重组,与SabinⅡ型株相比,VP1区分别变异7个和4个碱基,核苷酸同源性分别为99·22%和99·56%,氨基酸同源性分别为99·0%和99·67%。上述5株病毒在重要的减毒位点nt481、nt2909均发生突变。此研究中5株病毒分属于两个不同的传播链,但是共享nt481、nt2909、nt2992三个突变位点,这3个突变位点不在重组区域内,他们的共同作用可能是影响病毒传播力的重要因素,但目前尚无证据证明脊灰疫苗病毒型间重组会增加病毒的毒力及传播力。     

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革2型病毒D2-43株、D2-04株的基因组进行了全序列测定,在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序列进行了比较分析,结果表明D2 43株与D2-04株基因组全长约为10 723nt,核苷酸序列的同源性为95.1%,氨基酸序列的同源性为97 6%,不存在特别的高变区.这两株序列中共有83个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化,其中21个差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化,位于登革病毒粒子表面的E糖蛋白第126位氨基酸由Glu(D2-04株)→Lys(D2-43株)的变化对其抗原性有影响,可能引起了病毒对鼠神经毒力的改变.对结构糖蛋白E基因的聚类分析表明D2-43株与新几内亚株、台湾87株及菲律宾83株亲缘关系较近,D2-04株与牙买加株及巴西90年分离株的亲缘关系较近,表明我国存在不同起源的登革2型病毒感染.     

云南省登革3型病毒全基因组序列特征研究

为阐明云南省2013年和2016年登革3型病毒(DENV-3)流行株的全基因组分子进化特征及流行病学特点。采用C6/36细胞培养法从登革热患者血清中分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-3的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸和氨基酸同源性及系统进化分析。结果从云南省本地登革热患者血清中分离到10株DENV-3,其中西双版纳州2013年5株(简称版纳分离株),德宏州瑞丽市2016年5株(简称瑞丽分离株)。经RT-PCR和序列测定,获得这10株DENV-3的全基因组序列(10 707nt),其开放读码框(95~10 265)编码3 389个氨基酸。基于全基因组或各种结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化分析表明,版纳分离株均为基因II型(genotype-II),瑞丽分离株均为基因I型(genotype-I),并各自高度聚集为同一进化群并与东南亚流行株具有较近亲缘关系。版纳分离株间和瑞丽分离株间的全基因组核苷酸(氨基酸)同源性分别为99.75%~99.91%(99.40%~99.91%)和99.21%~99.68%(98.78%~99.57%),并与DENV-3原型株(H87)的核苷酸(氨基酸)同源性分别为94.21%~94.34%(97.88%~98.14%)和93.81%~93.98%(97.12%~97.67%)。与H87株比较,本次云南分离株结构蛋白和非结构蛋白分别存在26和63个氨基酸位点的改变。本研究证实,云南省西双版纳州2013年流行的DENV-3为基因II型,瑞丽市2016年流行的DENV-3为基因I型,它们的传播来源分别为老挝和缅甸北部边境地区。本次云南DENV-3分离株与H87株间存在明显差异,但决定病毒抗原性和毒力的关键位点未见明显变化。     

登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点的研究

pDVWS501为含有登革2型病毒全长cDNA的质粒, 可利用感染性转录体技术恢复为有活力的病毒MON501. 将MON501注射乳鼠脑内可引发脑炎症状, 其E蛋白的62, 203位分别为Glu, Asn. 采用OL-PCR方法把pDVWS501 E62位氨基酸突变为Lys, 得到质粒TB62; E203位氨基酸突变为Asp, 得到质粒TB203. 将pDVWS501, TB62和TB203酶切后体外转录得到全长登革2型病毒转录体, 应用电穿孔技术转染BHK-21细胞, 7天后收毒. RT-PCR证实有登革2型病毒存在, 接种C6/36细胞, 3~5 d可使其产生典型病变. 测定突变区域的序列, 结果表明得到了恢复病毒MON501和E62, E203位点突变的重组病毒HFT62, HFT203. 3株病毒均在其基因组5′端加“G”, 3′端则与登革2型病毒野生株相同. 分别将3株病毒稀释至10⁵~ 10² TCID₅₀, 经脑内途径注射1日龄乳鼠, 发现与MON501相比, HFT62, HFT203在同一稀释度发病乳鼠的个数减少, 发病时间延长且差异显著, 表明E62, E203可能是登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点.     

鸭肝炎病毒基因组3′末端序列的克隆和分析

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′UTR,而poly(A)尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%~37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围(18%~60%)之内;此外,Ⅰ型DHV的3′UTR在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。     

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计一对PCV-2特异性引物,用该室分离的PCV-2豫A株感染PK-15细胞,从中提取PCV-2复制型基因组DNA,并以之为模板进行PCR扩增.回收PCR产物,构建重组测序质粒T-PCV-2.测序结果表明,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为1767bp,与GenBank收录的PCV-2国外分离株核苷酸的同源性可高达97%.序列分析表明,复制型豫A株的基因组包含10个读码框架,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架,分别编码314、234个氨基酸.豫A株和PCV-1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为85%、66%,与其它PCV-2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在98%以上,而ORF2的氨基酸同源性为92%～97%.     

黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株的分离鉴定及全基因组序列分析

收集吉林蜂场的蜜蜂蜂蛹病料的RNA作为扩增模板,依据GenBank公布的黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)的全基因组序列,自行设计了10对引物,运用RT-PCR首次获得中国BQCV毒株的全基因组序列,命名为中国BQCV-JL1株。其全基因组序列由8 358个碱基组成,与GenBank公布的其他6株BQCV毒株的全基因组序列相比,同源性为86%~93%。中国BQCV-JL1株ORF 1的位置为546nt~4 676nt(4 131nt),ORF 2位于5 750nt~8 203nt,两个ORFs之间存在一段长为543nt(4 891nt~5 433nt)的ORF3。中国BQCV-JL1株第一个基因功能区ORF1′的位置为546nt~5 429nt,包含ORF 1和ORF 3。在ORF2之前存在内部核糖体进入位点(IRES),其末尾3碱基为CCU(5 642nt~5 644nt),为促进ORF 2翻译的起始密码子,中国BQCV-JL1株第二个基因功能区ORF2′的位置为5 642nt~8 203nt。中国BQCV-JL1株与Hungary 10(EF517515)同源性最高(93%),且分析核苷酸序列和氨基酸序列,与South Korea(JX149531)株最接近,表明中国BQCV-JL1株与South Korea(JX149531)株均有可能来自欧洲。中国BQCV-JL1株与其他6株全基因组序列在ORF位置划分上存在差异,其原因是部分位置发生基因突变。     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

云南省疫苗衍生脊髓灰质炎病毒全基因组序列遗传特征分析

为了解云南省疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(Vaccine-derived Poliovirus,VDPV)的基因组特征,对2010年及2012年监测到的4株VDPV进行全基因组序列测定。结果显示,2株Ⅱ型VDPV的基因组全长均为7439nt,与Sabin Ⅱ疫苗株全基因组核苷酸和氨基酸的序列同源性分别为95.4%和97.7%;2株I型VDPV基因组全长均为7441nt,与Sabin I疫苗株全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.9%和97.9%。减毒位点分析发现II型和I型VDPV毒株分别有两个(nt 481和nt 2909)和三个减毒位点(nt 480、nt 2795和nt 6203)发生了回复突变。VP1序列分析显示II型和I型VDPV毒株与相应Sabin株的变异分别为1%和2.3%,重组分析显示II型和I型VDPV的基因组结构分别为S2/S3和S1/S2/S1/S3,后者的重组次数高达3次,显示了重组的普遍性和复杂性,也表明了病毒在人体内复制和传播的持久性与重组的多样性成正相关。因此,从分子水平分析VDPV的特性,可掌握病毒的变异动态,为制定科学可行的VDPV控制策略提供理论依据。     

Sequence analysis of cloned dengue virus type 2 genome (New Guinea-C strain)

Sequences totalling 5472 nucleotides (nt) from four complementary DNA (cDNA) clones of the dengue virus type 2 (DEN-2) RNA (New Guinea strain, NGS-C) have been reported previously [Yaegashi et al., Gene 46 (1986) 257-267; Putnak et al., Virology 163 (1988) 93-103]. This report describes the complete nucleotide sequence, with the exception of about 7 nt at the 5'-noncoding region, of this RNA genome derived from several cDNA clones. It is 10,723 nt in length and contains a single long open reading frame of 10,173 nt, encoding a polyprotein of 3391 amino acids. The genomic organization is similar to that of other flaviviruses that have recently been reported. Among the three DEN-2 strains - the Jamaica genotype (DEN-2JAM), the DEN-2NGS-C, and the S1 candidate vaccine strain derived from Puerto Rico (PR)-159 isolate (DEN-2S1) - which have been sequenced to date, the amino acid sequences of the polyproteins bear 94%-99% similarity. When the amino acid sequences of DEN-2NGS-C are compared with those of the other two strains, the variations are greater in the DEN-2S1 than in the DEN-2JAM. When DEN-2 and DEN-4 are compared, the overall amino acid identities range from 30% to 80% in both the structural and nonstructural proteins; whereas between DEN-2 and DEN-1, they range from 68% to 79% in the region encoding the structural proteins and the nonstructural protein NS1.     

兔出血症病毒（RHDV）WHNRH株的分离鉴定及基因组全序列的测定与分析

从发病长毛兔中分离鉴定了兔病毒性出血症病毒WHNRH株。参考GenBank中已登录的RHDV毒株序列对RHDV WHNRH分离株进行了全基因组序列测定与分析。设计5对扩增区段相互重叠的RHDV特异性引物,扩增除5′和3′末端以外的序列,采用设计锚引物的5′RACE方法以及针对RHDV 3′末端的polyA结构设计引物获得了RHDV WHNRH株的5′和3′末端序列。胶回收各PCR产物,连接pMD 18-T克隆载体,测得RHDV WHNRH分离株的基因组全长为7437nt(不包括polyA),与GenBank公布的全部共6株RHDV全基因序列进行同源性比较分析,同源性在89.0%~97.1%之间,ORF1同源性为89.0%~97.1%,编码氨基酸序列的同源性为95.2%~98.7%;ORF2的核酸苷序列同源性为92.1%~97.7%,编码氨基酸序列的同源性为94.1%~96.6%。     

汉坦病毒HTN261株S基因片段的核苷酸序列测定及分析

黑龙江省是肾综合征出血热(HFRS)的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从疫区捕获的宿主动物-黑线姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进行了测定和初步分析。结果如下,HTN261株的S基因片段的全序列长为1697nt。只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37nt,终止于1326nt,编码的蛋白长为429aa。没有发现存在ORF2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HTN型中的病毒株的同源性很高,而与汉坦病毒其他型的同源性较差。从种系发生树分析来看,HTN261株归结于汉坦病毒的HTN型。在HTN型之内,HTN261株和HTN76-118株在一个分枝内。就其核苷酸和蛋白的同源性来说,HTN261株和HTN76-118株的同源性分别是89%(全S基因)和98%(蛋白)。而与中国境内发现的其他汉坦病毒株Z10,HU,Chen4,NC167等基因和蛋白的同源性相对较差。汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外,还具有其地理的簇集性。HTN261株和HTN76-118株之间S基因和N蛋白序列的变异性的差异分别为11%和2%,表明HTN261株和HTN76-118株还有不同,可能是不同的亚型。不过,尚有待于进一步研究证明。     

Complete nucleotide sequence and genome organization of tobacco mosaic virus isolated from Viciafaba

Based on reported TMV-U1 sequence, primers were designed and fragments covering the entire genome of TMV broad bean strain (TMV-B) were obtained with RT-PCR. These fragments were cloned and sequenced and the 5' and 3' end sequences of genome were confirmed with RACE. The complete sequence of TMV-B comprises 6 395 nucleotides (nt) and four open reading frames, which correspond to 126 ku (1 116 amino acids), 183 ku (1 616 amino acids), 30 ku (268 amino acids) and 17.5 ku proteins (159 amino acids). The complete nucleotide sequence of TMV-B is 99.4% identical to that of TMV-U1. The two virus isolates share the same sequence of 5', 3' non-coding region and 17.5 K ORF, and 6, 1 and 3 amino acid changes are found in 126 K protein, 54 K protein and 30 K protein, respectively. The possible mechanism on the infection of TMV-B in Vicia faba is discussed.     

一株保存的波瓦生病毒全基因组序列测定及分析

目的：对保存的WJBC株波瓦生病毒进行全基因组序列测定和分析,阐明其与已报道毒株之间的关系。方法：将波瓦生病毒基因组编码区分11段进行RT－PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM－Teasy载体后转化大肠杆菌DH5ct感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAstar软件将测序结果拼接得到全基因组序列。下载波瓦生病毒全基因组核苷酸序列,利用MEGA5．0软件构建系统进化发生树。结果与结论：WJBC株波瓦生病毒全基因组共11839nt,编码3415个氨基酸残基,病毒基因组5’端和3’端分别有111、483nt的非编码区;进化树结果显示,WJBC株波瓦生病毒与LB株波瓦生病毒的亲缘性最高,可能为同一病毒株．．     

肾综合征出血热病毒Gou3株M片段的分子特性及序列的比较分析

为测定我国肾综合征出血热病毒Ｇｏｕ３株的Ｍ片段全基因序列,了解该株分子基础,并分析其瑟其他病毒株的差异,将提取的感染了病毒的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞总ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增,产物直接或纯化后克隆Ｔ载体并测定序列,结果测得Ｇｏｕ３株Ｍ片段的全基因序列共３６５１个核苷 ,最大读码框架从４７到３４４８,共编码１１３４个氨基酸。     

汉坦病毒HTN261株S基因片段的核苷酸序列测定及分析

黑龙江省是肾综合征因热（HFRS）的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从疫区捕获的宿主动物－黑线姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进测定和初步分析。结果如下,HTN261株的S基因片段的全序列长为1697nt。只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37nt,终止于1326nt,编码的蛋白长为429aa。没有发现存在ORF2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HGTN型中的病毒株的同源性很高,而与汉坦病毒其他型的同源民生较差,从种系发生树分析来看,HNT261株归结于汉坦病毒的HTN型。在HTN型之内,HTN261株和HTN76－118株在一个分枝内,就其核苷酸和蛋白的同源性说,HT N261株和HTN76－118株的同源性分别是89％（全S基因）和98％（蛋白）。而与中国境内发现的其他汉坦病毒株Z10,HU,Chen4,NC167等基因和蛋白的同源性相对较差,汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外,还具有其地理的簇集性。HTN261株和HTN76－118株之间S基因和N蛋白序列的变异性的差异分别为11％和2％,表明HTN261株和HTN76－118株还有不同,可能是不同的亚型。不过,尚有待于进一步研究证明。     

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14—12—1—7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14 12 1 7株进行全序列测定和分析 ,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制。根据已发表的SA14 14 2株及SA14 株的序列 ,设计 6对重叠引物 ,涵括整个乙脑病毒的基因组 ,通过RT PCR扩增出SA14 12 1 7株的各cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测序。结果表明SA14 12 1 7株基因组全序列长 10 976个核苷酸 ,从 96到 10 394为一个长开放读码框 ,编码 3432个氨基酸。与野毒株SA14 和疫苗株SA14 14 2的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,E区有 5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同 ,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关。此外 ,NS3、NS5和 3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关。综上所述 ,乙脑病毒减毒中间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义