鲈鱼IgM重链基因cDNA的克隆及其原核表达

采用同源克隆和RACE技术扩增到鲈鱼 (Lateolabrax japonicus) 免疫球蛋白M (Immunoglobulin M,IgM) 重链 (Heavy chain,H) 基因全长cDNA序列。鲈鱼IgM cDNA全长为1 901 bp,开放阅读框包含1 749 bp,编码582个氨基酸。根据鲈鱼IgM和其他硬骨鱼免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列构建的系统发育树表明IgM、IgZ和IgD分别聚为一枝,其中IgM与IgZ分支的进化关系较近,而与IgD分支的进化关系较远。RT-PCR检测IgM在鲈鱼各组织器官的表达情况,其中在头肾及脾脏中表达量最高,心脏、肌肉及脑中几乎不表达。利用已获得的鲈鱼IgM cDNA序列,构建原核表达载体pQE30-IgM,并在M15大肠杆菌中成功诱导表达了分子量为63kD的重组蛋白His-IgM,Western-blotting显示鲈鱼IgM重组蛋白能与鼠源抗6×His的单克隆抗体特异性结合,说明已经获得了基因工程表达IgM重链蛋白。     

黄颡鱼Cu稳态相关基因ccs和cox17的原核表达及多克隆抗体制备

为深入研究黄颡鱼Tachysurus fulvidraco Cu稳态调控机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得了810和192 bp的ccs (Pfccs)和cox17 (Pfcox17)基因编码序列,并成功构建了p ET32a(+)-Pfccs和p ET32a(+)-Pfcox17重组表达载体;转化重组质粒到E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞中,以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达,发现PfCCS蛋白主要在沉淀中表达, PfCOX17蛋白主要在上清中表达;分别采用包涵体和亲和层析纯化的方法得到了纯度较高的重组PfCCS和PfCOX17蛋白;以纯化得到的PfCCS和PfCOX17蛋白免疫Balb/C小鼠3次,制备多克隆抗体。通过Western Blot鉴定了PfCCS和PfCOX17抗血清可以分别特异性识别重组PfCCS和PfCOX17蛋白,也可以分别特异性识别黄颡鱼内源性CCS和COX17蛋白。通过Western Blot对黄颡鱼CCS和COX17蛋白在鳃、心脏和肝脏中的分布情况进行检测,发现黄颡鱼CCS和CO...     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifD基因的克隆、原核表达及纯化

基于NCBI数据库中固氮菌nif D基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E为模板,通过PCR方法获得了Klebsiella variicola DX120E nif D基因的ORF;以p ET30a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒p ET30a-nif D。将正确的重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3),在28℃培养条件下经1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-ply-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达;通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。结果表明,本研究克隆得到甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif D基因的ORF为1 452 bp,编码483个氨基酸;原核诱导表达后经提纯和质谱鉴定,该蛋白等电点为5.90,分子量为53.87 k D,与预期大小一致。该蛋白在原核表达系统中以包涵体的形式成功表达。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白,为今后单克隆抗体的制备、蛋白质印记杂交检测(Western Bloting)等研究奠定了基础。     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒单链抗体基因原核表达质粒的构建及高效表达

在原核系统中高效表达抗狂犬病毒单链抗体scFv41,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。以重组质粒pCANTABscFv41为模板,PCR扩增带NcoI和NotI位点的scFv41基因,克隆入原核表达载体pET-22b( ),酶切鉴定重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。竞争ELISA检测表达蛋白的特异结合活性。酶切鉴定证实scFv41基因已插入原核表达载体pETl-22b( ),重组表达质粒pET-scFv41在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达量约占菌体蛋白总量的30％。竞争ELISA检测结果表明scFv41表达蛋白可特异抑制抗狂犬病毒IGY与狂犬病毒的特异性结合。该实验为进一步研究scFv41的生物学特性和免疫保护作用,及基因工程抗体的制备奠定了基础。     

重组原核表达载体pQE30-HPV58L1的构建及鉴定

目的：构建重组原核表达载体以获得HPV58L1活性蛋白,为进一步研制HPV58基因工程疫苗打下基础。方法：用聚合酶链反应（PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pUC19质粒中并测序。利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-HPV58L1,并通过酶切电泳验证重组结果的正确性。结果：PCR扩增出1.6Kb特异性片段,经克隆至pUC19后测序表明序列同源性与Gen-Bank报道一致。重组质粒pQE30-HPV58L1酶切后显示其大小约5.1Kb,酶切图谱与预期相同。结论：成功构建了重组原核表达载体pQE30-HPV58L1。     

重组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析

用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后,亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coliBL21(DE3)plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmol／LIPTG诱导4h后获得可溶性表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的18.45％,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTA相对分子量相符,约32kDa左右。表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度约达97.53％,并可得到约18mg/L重组RTA蛋白。Western印迹和间接ELISA结果证明,重组RTA蛋白与抗天然蓖麻毒素多抗可发生特异性的抗原抗体反应,具有良好的抗原性,这为制备RT特异性抗体及建立RT的检测方法奠定了基础。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

内江猪IL-18基因的克隆及原核表达

以ConA刺激的内江猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)为模板,采用RT-PCR技术扩增出猪IL-18全长基因,克隆其成熟蛋白的编码基因(471bp)至pMD18-T克隆载体,经双酶切和测序获得阳性克隆。通过EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切及连接反应,构建了pET-32a( )-IL-18原核表达质粒。经双酶切和DNA测序证实重组质粒构建正确,将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot证实表达出35kD左右的融合蛋白。经实验确定重组内江猪IL-18蛋白诱导表达的最佳条件为IPTG 0.2mmol/L,30℃诱导培养5h。在最佳表达条件下,pIL-18的相对含量为59.6%。内江猪IL-18的原核表达为重组IL-18的纯化及其生物学功能的进一步研究提供了基础。     

黄颡鱼自噬相关基因 LC3B和Beclin1的原核表达及多克隆抗体制备

为深入研究黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco自噬的发生过程和机制, 从黄颡鱼cDNA中克隆获得372和1344 bp的黄颡鱼LC3B(PfLC3B)和Beclin1(PfBeclin1)基因编码序列, 并成功构建了pET32a(+)-PfLC3B和pET32a(+)-PfBeclin1重组表达载体, 分别采用亲和层析和包涵体纯化的方法得到了纯度较高的重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白; 以重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白免疫Balb/C小鼠, 制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfLC3B和PfBeclin1抗血清可以分别特异性识别重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白; PfLC3B抗血清可以特异性识别黄颡鱼内源性LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白, PfBeclin1抗血清可以特异性识别黄颡鱼内源性Beclin1蛋白。蛋白水平的组织分布显示, 黄颡鱼LC3和Beclin1蛋白在肝脏中表达水平均较高, 在肾脏和脾脏中的表达水平较低。综上所述, 研究成功制备了黄颡鱼LC3B和Beclin1的多克隆抗体, 为深入研究黄颡鱼自噬机制提供了有力工具。     

兔多杀性巴氏杆菌C51-3株黏附蛋白的表达、纯化及其抗原性检测

应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。     

His-FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建His标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA的融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中表达,为进一步研究femA基因的生物学功能和临床应用奠定基础.方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌femA基因序列,利用Primer Premier 5.0设计PCR引物,并在引物的5'加入BamHI及SalI酶切位点;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模版,PCR扩增出femA基因片段.将目的DNA片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR、双酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的pQE30-femA重组质粒转化大肠埃希菌JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-femA融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证.结果 经PCR、双酶切签定及序列测定,证实重组质粒pQE30-femA构建成功;重组质粒pQE30-femA转化大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析显示表达出53 kD目的蛋白;经Bandscan软件分析,目的蛋白质在4h的表达量占细胞总蛋白的27.5％.结论 成功构建了His-FemA原核表达载体(pQE30-femA),并在大肠埃希菌中高效表达.     

水稻蔗糖转运载体蛋白(OsSUT2)非跨膜区域特征性序列的融合表达及其抗体制备

植物光合作用产生的蔗糖是植物生长发育的主要碳源物质,还是诱导植物生长发育过程中诸多相关基因表达的特异信号分子[1].蔗糖分子在植物器官及组织间的生理分配维持着整个植物体的正常生长发育[2].植物蔗糖转运载体(sucrosetransporter,SUT)是一类担负着蔗糖分子在细胞间的转运及信号转导的功能性蛋白家族,它在蔗糖的韧皮部装载、沿韧皮部的再吸收、韧皮部卸载和向库器官的转运等跨膜运输以及蔗糖特异信号感应过程中发挥着重要的生理功能[3～5].植物蔗糖转运载体蛋白分布于植物细胞质膜上,该转运载体蛋白含有12个疏水性跨膜结构域,在其氨…     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。     

禽多杀性巴氏杆菌P1059成熟黏附蛋白的原核表达、纯化和抗原性检测

目的：建立rCPM36在大肠杆菌中的表达体系,纯化表达产物并检测其抗原性。方法：运用PCR方法从禽多杀性巴氏杆菌国际标准株P1059基因组中扩增出编码36kDa成熟黏附蛋白的cpm36基因,构建原核表达载体pQE30-cpm36,转化到大肠杆菌M15中并诱导表达目的蛋白,用镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白及制备其抗体,Western印迹分析其抗原性。结果：SDS-PAGE结果显示目标蛋白以可溶性形式表达在大肠杆菌M15细胞质中,其相对分子质量为37kDa,Western印迹结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。结论：成功构建出原核表达载体并实现了目的蛋白表达,用镍离子螯合层析柱纯化得到具有抗原性的蛋白,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌黏附因子和保护性抗原的研究奠定基础。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链融合基因的克隆及原核表达分析

构建了霍乱毒素B亚单位(choleratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素(insulin)B链的融合基因CTB-INSB,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pETCIB;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后的表达产物经15％SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,其分子量约为15.4kDa,且主要以包涵体形式存在,约占全菌蛋白的30％。含CTB-INSB重组蛋白的包涵体经变性和复性后,可在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果显示CTB-INSB可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别,表明该蛋白具有霍乱毒素B亚单位与胰岛素的双重抗原性。同时GM1-ELISA分析结果表明CTB-INSB在体外可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异结合,进一步证实了它能够形成类似CTB五聚体的高级结构,具有生物活性。