成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。     

临床死亡川金丝猴心肌炎病例的诊断及病因分析

对临床送检的急性死亡川金丝猴进行解剖,观察各组织脏器的大体病理变化并对其进行中性甲醛固定、石蜡包埋切片和病理组织学分析;无菌操作进行肉汤法分离培养细菌和细胞培养法分离病毒,通过形态学、动物回归试验和RT-PCR 方法对分离的病原进行培养、鉴定。结果,眼观心肌呈局灶性坏死,镜下心肌纤维断裂、崩解,肌间有大量炎性细胞浸润,呈典型的病毒性心肌炎变化;从肺脏中分离获得大肠杆菌;电镜负染可见心肌组织匀浆液和心包积液以及其Vero 细胞培养物中均有直径在20 ～ 25 nm,形似小RNA 病毒的粒子存在;RTPCR检测结果说明所分离病毒为柯萨奇B 型病毒;动物回归试验证实,分离的大肠杆菌对昆明种小鼠无致病性,而分离的病毒对小鼠有致病性,且病理组织学变化与金丝猴相似。根据临床症状、病理剖检和病理组织学变化特征,结合病原分离结果综合分析,推测该金丝猴死亡的原因可能与该病毒感染有关。      

川金丝猴柯萨奇病毒的分离鉴定

利用细胞培养方法从长春某动物园送检的死亡川金丝猴心脏中分离获得1株柯萨奇病毒,经系统的形态学、理化学、动物回归试验和RT-PCR扩增,符合柯萨奇B型病毒特征;进而对其VP1基因部分序列和特异性血清抗体分析,证明所分离的病毒为柯萨奇B3型病毒.这是国内外首次从金丝猴分离到该病毒,暂命名为CVB/SGM-05.     

Wnt途径—调控细胞增殖和癌变的关键途径

Wnt/Wingless途径是调控细胞生长增殖的关键途径,在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。由于肿瘤抑制基因APC失活突变或原癌基因β－catenin激活突变等因素引起的该途径的异常激活可以启动下游靶基因c-myc和cyclin D1,致使细胞恶性转化,发生肿瘤,尤其是结肠癌。本文对Wnt-APC-β-catenin-TCF/LEF-c-myc/cyclin D1信号途径的最新研究进展作一综述。     

山黧豆根适应铕环境生理代谢的表达

对培植在砂基中的山黧豆 LathyrussativusL. 幼苗经0.5mmol·L-1Eu3+和水 对照 根灌处理后,用扫描电镜和X-射线能量色散谱仪顺序定位检测根横断面表皮、外皮层、内皮层、维管柱各元素的百分含量;同时测定了与检测元素相关的根内活性氧、多胺产生生理活性指标.由于Eu3+的影响,使其根内响应产生生理代谢机制的变化,分布在根横断面不同组织中的各元素的百分含量不一样,主要是对生物活性中起作用的P、S、Ca、Mn4种元素影响较大,与测定的其它元素相比较,代谢利用率高;元素由低活性部位向高活性部位流动,表现出各元素由外向内,由表皮吸收运送到维管柱韧皮部、筛管运至植物各器官被利用的规律性.同时,由于Eu3+价态变化引起二者相关酶中离子的价态变化,致使植物体内自由基和多胺产生机制的响应变化,二者之间存在着一定的互补性,二者比值始终维持在一定的比例水平上,是Eu3+影响二者之间存在着的共同活性位点起作用的结果.     

志贺毒素B（ShT-B）亚单位在两种表达载体中表达形式分析

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEMTB3克隆质粒,得到大小约为225bp的ShTB基因片段,分别将其插入到经双酶切的pQE40和pQE30表达载体中,构建了2个ShTB的重组表达质粒pQE40B3和pQE30B2,分别转化到E.coliM15,经IPTG诱导后,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中,pQE40B3表达蛋白约占菌体总蛋白的37%,主要为包涵体形式。pQE30B2表达蛋白约占菌体总蛋白的16%,主要为可溶性形式,约9.2%。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

志贺毒素A／B（ShT-A／B）亚单位基因的克隆与序列分析

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺茵(Shigella dysenteriae type Ⅰ)中,分别扩增出约895bp和225bp的成熟ShT-A,B基因片段,直接克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-ShTA_2和pGEM-ShTB_3。测序结果表明,插入的片段是ShT-A,ShT-B,且与GenBank中ShT-A,B核酸序列完全一致,从而为重组ShT-A,B的表达研究奠定了基础。     

维甲酸诱导的人大肠癌细胞凋亡

本研究应用光镜、电镜技术、DNA凝胶电泳、流式细胞术及末端脱氧核苷酰转移酶原位标记(TUNEL法),观察全反式维甲酸ATRA诱导的人大肠癌CCL229细胞凋亡特征。RA诱导CCL229细胞凋亡,光、电镜下观察到凋亡小体形成等典型的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳上呈现特征性的DNA ladder,DNA直方图上显示亚二倍体峰。10-8mol/L-105mol/L范围内,RA诱导CCL229细胞凋亡表现出时间和剂量依赖性。     

志贺毒素B(ShT-B)在E.coli中的融合表达及特异性抗体制备

用KpnⅠ、HindⅢ酶切克隆载体pCEM-ShTB_3,然后亚克隆入带有二氢叶酸还原酶(DHFR)的融合表达载体pQE40,构建重组质粒pQE40-ShTB. 转化到E.coli M15中,经IPTG诱导,实现了ShTB-DHFR融合蛋白的高表达,表达量约占菌体总蛋白的21.9％,为包涵体形式。在变性条件下,包涵体蛋白经螯合镍离子的次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和柱一步纯化,得到了纯度为90.5％的重组ShT-B.以纯化的ShTB-DHFR融合蛋白免疫昆明鼠,并结合腹腔注射S180细胞,成功制备了抗ShTB腹水多克隆抗体,效价达1∶1×10~6.间接ELISA和Western印迹结果表明,抗ShT-B多抗与重组蛋白和天然ShT均有特异性结合。本试验结果为毒素检测方法的研究奠定了基础。     

志贺毒素及其分子生物学研究进展

志贺毒素(ShT)是由Ⅰ型痢疾志贺菌产生的一种重要的致病毒力因子,具有细胞毒、肠毒和神经毒三种毒性作用。近年来,ShT已被列入生物武器核查清单剂中禁控毒素之一,成为潜在的生物毒素战剂和生物恐怖病原。本主要概述了ShT的生物学特性、分子结构与作用机制、检测与预防,以及分子生物学的研究进展。