HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24 供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8 T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.     

HLA-B2704重链胞外功能区基因片段的克隆表达及其生物学功能的初步鉴定

目的:克隆及可溶性表达 HLA-B*2704重链胞外功能区,并对其生物学功能进行初步鉴定.方法:以HLA-B 位点全长 cDNA 为模板,用 PCR-SSP 方法扩增 HLA-B*2704重链胞外区 cDNA,经测序鉴定后与 pET32a 可溶性核表达载体构建其重组核表达系统,并在大肠杆菌 BL21中表达,采用 Western 印迹及微量淋巴细胞毒阻断实验初步鉴定该蛋白的特异性及其生物学特性.结果:扩增出 HLA-B*2704重链胞外功能区 cDNA 片段,构建的HLA-B*2704 cDNA-pET32a 可溶性核表达载体可在大肠杆菌 BL21表达系统中得到较好表达,表达量约占菌体总蛋白的40%;通过 Western 印迹鉴定了表达蛋白的特异性;通过微量淋巴细胞毒阻断实验发现该重组蛋白具有生物活性并可特异性阻断 HLA-B27阳性细胞的微量淋巴细胞毒反应.结论:在大肠杆菌中表达了具有生物学活性的HLA-B*2704重链胞外功能区,为强直性脊柱炎的机理研究及特异性阻断药物的筛选提供了实验基础和新的靶标.     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

小菜蛾气味受体蛋白PlxyOr83b基因的克隆及表达

【目的】克隆小菜蛾Plutella xyostella气味受体Or83b基因, 并进行原核表达, 为研究小菜蛾寄主选择行为的分子机理, 开发昆虫行为调节剂提供基础。【方法】提取小菜蛾的总RNA, 反转录获得总cDNA, 采用RT-PCR方法扩增目的基因, 将其克隆至T载体并测序, 然后将目的基因克隆到大肠杆菌Escherichia coli表达载体pET-32a (+)中表达。经酶切、 PCR及测序鉴定正确后转化BL21 (DE3)菌株, 用IPTG诱导表达, 通过SDS-PAGE, Western印迹鉴定表达蛋白。【结果】获得了编码小菜蛾Or83b的cDNA序列, 该基因阅读框长1 413 bp, 编码471个氨基酸, 预测的等电点为7.19, 命名为PlxyOr83b（GenBank登录号为GQ923610）; 成功构建了pET-PlxyOr83b原核表达重组质粒, 目的基因获得高效表达, 其融合蛋白分子量为32.0 kD, Western blot 检测结果进一步表明PlxyOr83b在大肠杆菌DE3中得到正确表达。【结论】成功克隆和表达了小菜蛾气味受体基因PlxyOr83b, 该基因与其他昆虫Or83b基因基本一致。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

GST-IL-21融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性测定

目的:克隆人白细胞介素21(IL-21)编码区的cDNA,在大肠杆菌中得以表达,并检测其促进人外周血单核细胞(PBMC)增殖的生物学活性。方法:利用基因工程技术,以植物血凝素(PHA)刺激的人扁桃体细胞cDNA文库为模板,经PCR扩增获得IL-21的编码基因,并将其重组于表达载体pGEX4T-2中,转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达,纯化得到GST-IL-21重组融合蛋白;MTT法检测其对促进PBMC增殖的功能。结果:获得了IL-21编码区的cDNA克隆;SDS-PAGE显示经IPTG诱导表达的该融合蛋白相对分子质量为41000;纯化后的GST-IL-21融合蛋白在体外具有显著的促进PBMC增殖的作用。结论:GST-IL-21融合蛋白在原核表达系统中可以有效表达,并具有较好的生物学活性。     

猪Follistatin cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

提取猪卵巢总RNA,用RT-PCR方法克隆了猪FollistatincDNA的完整开放阅读框,长1038bp。将FollistatincDNA连接到原核表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导,进行了GST-FS融合蛋白表达。用SDS-PAGE和Western杂交检测,结果显示在63kD处有特异性表达蛋白。     

重组人胱抑素C的原核表达及鉴定

目的构建重组人胱抑素C（cystatinC,CysC）的原核高效表达质粒,诱导表达并纯化获得CysC重组蛋白。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计CysC编码基因序列,人工合成目的基因克隆至pET-22b（＋）表达载体中,测序及酶切鉴定正确后诱导其在大肠埃希菌BL21中表达,所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化后采用SDS—PAGE及Western印迹鉴定。结果酶切结果证实构建的表达质粒结构正确;测序结果显示克隆的基因序列所编码的蛋白与GenBank中的CysC氨基酸序列相符;SDS-PAGE及Western印迹结果证实获得的重组CysC融合蛋白分子量约为16kD,经NP亲和层析纯化获得纯度大于90％的目的蛋白。结论建立了重组人CysC的原核高效表达系统并获得了CysC重组蛋白。     

钙激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建钙激活酶激活蛋白基因（UK114）的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为32℃,诱导时间为4 h,菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素前体蛋白的克隆与表达

促性腺激素释放激素（gonadotropin—relying hormone,GnRH）是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对性腺发育的作用,构建了GnRH cDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT—PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL—c2x中构建重组表达质粒pMAL—GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41．6％。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose—sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经Factor Xa酶切裂解,Amylose—sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。该研究为鱼类GnRH蛋白的控制性腺成熟和抗体制备打下了基础．是国内鱼类GnRH前体蛋白在原核细胞中成功表扶的首次报道．     

肉毒毒素蛋白受体syt II N端片段基因的合成及其在大肠杆菌中的融合表达

本研究旨在构建肉毒毒素蛋白受体sytII N端片段的原核表达载体,并在大肠杆菌pMAL-c2x系统中表达MBP-Syt融合蛋白。根据GenBank中已报道的人syt II基因序列,截取N端氨基酸序列,依据大肠杆菌的偏爱密码子,设计引物人工合成全基因,将全长基因克隆至原核表达载体pMAL-c2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli ER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Amylose Resin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和免疫印记对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析,为进一步研究毒素与受体相互作用的机制奠定基础。     

前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

15-羟基前列腺素脱氢酶（PGDH）属于抑癌基因,在多种肿瘤中表达缺失,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,测序鉴定正确后转化E.coli DH5α,经温控诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot,证实为相对分子质量约为29000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。经Ni2+配体亲和层析纯化得到纯度大于95%的目的蛋白。重组PGDH简单复性后具有一定的生物活性,约为3.7×104U/mg,为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.