食物中多不饱和脂肪酸在家蝇幼虫体内的富集与代谢及对其生长的影响

【目的】阐明家蝇 Musca domestica 幼虫对食物中各种多不饱和脂肪酸的富集能力以及代谢转化情况,并探究各种多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。【方法】在基础饲料中添加不同浓度(3%, 6%和12%)的多不饱和脂肪酸(亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸)饲养经过脱脂传代培养的家蝇幼虫;提取家蝇幼虫的总脂肪酸,利用气相色谱仪进行检测和分析;测定统计幼虫体重,以分析多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。【结果】亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在家蝇幼虫体内均能被富集,且它们的富集程度随着食物中多不饱和脂肪酸的添加浓度的升高而增加,其中亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在幼虫体内富集的最高含量(占体内总脂肪酸的比例)分别为21.93%, 16.13%和9.68%,而二十二碳六烯酸不能在家蝇幼虫体内富集,提示家蝇幼虫食物中添加的各种多不饱和脂肪酸经过代谢后并没有在其体内产生新的脂肪酸,而食物中添加的二十二碳六烯酸在家蝇幼虫体内被分解代谢后消除。饲喂α-亚麻酸及花生四烯酸后家蝇幼虫体重增长较为明显,其中6%α-亚麻酸添加组的幼虫体重显著高于对照组(取食脱脂饲料)和3%和12%α-亚麻酸添加组,3%和6%花生四烯酸添加组的幼虫体重显著高于对照组和12%花生四烯酸添加组。【结论】家蝇幼虫体内能够从食物中富集部分多不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸碳链越长其富集程度越低直至不能富集,富集的多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长有不同程度的影响。     

家蝇幼虫血淋巴中抗真菌肽的诱导方法比较及抗真菌活性

以未诱导组作为空白对照研究比较真菌诱导、超声诱导和热诱导家蝇Musca domestica 幼虫血淋巴初提液的抗真菌肽效果,比较各种诱导方法诱导后的幼虫存活率;用凝胶层析法和高效液相分离纯化热诱导家蝇3龄幼虫抗真菌肽,检测其抗白假丝酵母菌Candida albicans和新生隐球菌Cryptococcus neoformans活性;SDS-PAGE分析抗真菌肽的蛋白分子量范围。结果表明：3种诱导方法诱导后家蝇幼虫均产生具有明显抗真菌作用的抗真菌肽,其初提液抑菌圈大小没有明显差别;真菌诱导组和热诱导组幼虫存活率低于对照组,而超声诱导组与对照组相比则无明显差别。经分离纯化后,抗真菌肽仍具有较好的抗真菌活性;SDS-PAGE分析表明该抗真菌肽有效成分的蛋白分子量在14.4 kD以下。结果提示热诱导家蝇幼虫产生抗真菌肽是一种方便、有效的诱导方式。     

家蝇泛素结合酶基因的生物信息学分析

利用EST测序技术从家蝇幼虫cDNA文库中获得家蝇泛素结合酶基因(MD-E2)cDNA序列,采用NCBI、ExPASY中的相关工具,对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析,MEGA软件构建了进化树。结果表明,家蝇泛素结合酶基因的cDNA序列具有完整的ORF框,全长480 bp,一共编码159个氨基酸。其编码的蛋白质理论分子量为18.117 9 kD,等电点8.64,无信号肽及跨膜区,属于亲水性蛋白,具有泛素结合酶家族的活性位点(FHPNVYPSGTVCLSLL),主要分布于细胞核;二级结构以无规则卷曲为主,β折叠较少。     

家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

家蝇Phormicin A多克隆抗体的制备及效价检测

家蝇Phormicin作为防御素家族的成员,是一类具有广普抗菌活性的抗菌肽.本研究采用原核表达法表达并纯化获得了家蝇PhormicinA蛋白.将家蝇Phormicin A原核表达蛋白与完全佐剂和不完全佐剂乳化混匀,先后免疫新西兰白兔获得其多克隆抗体.通过原核表达蛋白中和吸附实验,以及Western blot实验验证了抗体的特异性.进一步用金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫样品,进行内源性验证并测定抗体的效价.结果 显示,该多克隆抗体既可以识别家蝇Phormicin A原核表达蛋白,也可以识别金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫产生的内源性Phormicin A蛋白.本研究为进一步探索Phormicin在家蝇天然免疫和防御中的机制等后续工作打下基础.     

根癌农杆菌介导的Pr1基因在贵阳腐霉的组成性表达

【目的】构建组成性表达贵阳腐霉Pr1基因的载体pCambia-hph-Pr1,转化贵阳腐霉,以获得高毒力的基因工程转化菌株。【方法】以双元载体pCambia-Pnos-PNN-hph为基本骨架,将Pr1基因置于组成型启动子PgpdA和终止子TtrpC之间,获得含Pr1基因的表达元件。以贵阳腐霉菌丝体为受体材料,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法转化贵阳腐霉,观察转化株的生物学特征和灭蚊毒力。【结果】转化株的菌丝生长速度和游动孢子产量与野生株无显著性差异。生物测定表明转化株对蚊幼虫平均致死率达到32.9%,比野生株提高了约一倍,并且使受试蚊幼虫生长速度明显减缓。【结论】利用根癌农杆菌介导的遗传转化获得了遗传稳定的高毒力菌株。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

不同诱导条件下家蝇(Musca domestica)三龄幼虫免疫相关基因的表达研究

旨在研究在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。采用冷刺激、热刺激及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌注射诱导12 h后提取家蝇三龄幼虫总RNA。根据GenBank公布的家蝇磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因、攻击素(Attacin)、天蚕素(Cecropin)、防御素(Defensin)、双翅肽(Diptericin)、溶菌酶(Lysozyme)、热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)及家蝇抗真菌肽(MAF-1)基因序列进行RT-PCR反应,以GAPDH基因为内参照,分析在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。结果显示,不同条件诱导下,家蝇免疫相关基因表达显现较大差异,微生物诱导比物理刺激诱导后家蝇免疫相关基因表达水平高;真菌、阳性菌诱导后家蝇免疫相关基因表达量最高,阴性菌次之;冷刺激诱导最低。微生物及物理刺激均能激活家蝇的免疫系统,在不同条件刺激下,家蝇幼虫机体免疫应激反应不同。     

按蚊防御素基因家族转录模式和启动子的生物信息学分析

运用生物信息学方法分析冈比亚按（Anopheles gambiae）中防御素基因家族的表达模式和启动子保守区。在ENSEMBL数据库中搜索防御素基因家族序列,然后将基因编号输入angaGEDUCI数据库中进行分析。结果在冈比亚按蚊中存在有4个防御素基因的异构体分子,其中DEF1基因表达模式与其它3个基因存在明显差异。4个防御素基因启动子序列都存在AP-1、GATA-1、GCN4、GR、HNF-3B、TFIID6个转录因子的识别结合位点,表明这6个转录因子是冈比亚按蚊防御素基因家族表达调控所必需的。值得注意的是,DEF1基因启动子序列中存在与性别决定翦关的SOXproteins转录因子的结合位点,暗示DEF1基因的转录调控可能与性别分化有关;而在DEF2基因启动子序列中存在有热激因子（HSTF）的识别结合位点,表明热刺激会调控DEF2基因的表达。     

家蝇幼虫血淋巴蛋白组及血淋巴中热稳定蛋白研究

目的 初步研究家蝇幼虫血淋巴蛋白组学特征及其中的热稳定蛋白.方法 使用破壁法提取三龄幼虫血淋巴原液,设置全血淋巴组、沸水浴处理组,采用不同pH范围双向电泳胶条,分析血淋巴中蛋白的pH、分子量分布特点,采用二级质谱对蛋白点进行分子鉴定.结果 家蝇幼虫血淋巴中蛋白的分子量主要分布在10 kDa～66kDa之间,采用pH3～10的IPG胶,检测到286个蛋白点,采用pH4～7的IPG胶,测到601个蛋白点;血淋巴经沸水浴处理后,检测到41个蛋白点,分子量低于30 kDa,比未处理组减少了93.1％,对其中11个蛋白点进行质谱分析,鉴定出4个功能蛋白,包括存储蛋白、气味结合蛋白、铁蛋白重链样蛋白和铁蛋白2轻链蛋白同系物.结论 双向电泳能很好地分析家蝇幼虫血淋巴中的蛋白,血淋巴中的蛋白等电点主要分布在pH4～7之间;血淋巴经沸水浴处理后可去掉大量变性蛋白,其上清中可能包含耐热性较好的功能蛋白.