可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

铜绿假单胞菌SOS反应阻遏蛋白LexA的复性及活性研究

目的:对LexA蛋白复性方法进行优化,对复性后的LexA蛋白的生物学活性进行分析。方法:采用含有GSH/GSSG的缓冲液,一步稀释法对变性LexA蛋白进行复性,用镍离子亲合柱及阳离子柱层析法对复性后的LexA蛋白进行纯化,再以Sephadex G-25凝胶柱脱盐,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和RP-HPLC法检测复性效果,Western blot法分析复性前后及经DTT处理后的LexA蛋白的免疫反应性,凝胶滞留电泳试验检测复性LexA蛋白与DNA的特异性结合能力。结果:复性后的LexA蛋白出现单体和多聚体的形式,多聚体是由单条肽链聚合而成。LexA单体和多聚体与兔抗LexA多克隆抗体均有较好的反应性。复性后的LexA蛋白能与SOS盒序列发生特异性结合。     

可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL~100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24 供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8 T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析

目的：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex 75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析LexA的免疫活性。结果：LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。