猪骨骼肌MyHC-Ⅱb基因上调表达的分子机制

哺乳动物骨骼肌由各种不同类型的肌纤维镶嵌而成,不同类型肌球蛋白重链的表达是造成不同类型肌纤维的主要原因.目前已知的肌球蛋白重链家族包含8种亚型,其中长白猪骨骼肌My HC-Ⅱb的表达量显著高于中国地方猪,然而造成这种差异的分子机制未见报道.本研究用荧光定量PCR证明了长白猪背最长肌中My HC-Ⅱb m RNA的表达量显著高于莱芜猪(P=0.013).删除实验结果表明,从转录起始位点上游-1024 bp删除到-187 bp之后,My HC-Ⅱb表达量显著下降,分析发现,在这段启动子区域内存在3个E-box序列;分别突变这3个E-box序列后,My HC-Ⅱb启动子驱动的荧光素酶活性显著下降(P=0.036).另外,在My HC-Ⅱb上游启动子区?1398 bp处发现一个GT的突变,所检测的64头莱芜猪在该位点全部为GG型,65头长白猪中13头为GG型,16头为TT型,36头为GT型.在C2C12细胞系中的转染实验结果显示,G突变为T之后有增加My HC-Ⅱb表达的趋势.Western blot的结果表明,转录因子Myo D在两猪种间表达差异不显著(P=0.136),而Myf-5在长白猪中的表达量极显著高于其在莱芜猪中的表达量(P=0.0036).这些数据表明,Myf-5是造成猪My HC-Ⅱb基因m RNA上调表达的重要因素之一.     

大麦水孔蛋白基因HvTIP2;1及其启动子的表达特性分析

组织特异性启动子作为基因工程的一种重要调控元件,在生物反应器、转基因新品种培育等领域有重要的应用前景。基于芯片数据的基因数字化差异显示分析,筛选到一个根特异表达的大麦水孔蛋白基因Hv TIP2;1,利用实时荧光定量RT-PCR方法了解该基因在不同组织和处理条件下的表达特性,并对基因启动子及功能进行了研究。结果表明,Hv TIP2;1表达具有根特异性并受植物生长发育的调控,其在成株期的表达量明显高于苗期。ABA激素处理组,Hv TIP2;1表现先上升,处理10h后又下降的表达变化趋势;铝、锰有毒金属离子处理组,Hv TIP2;1表达量明显高于对照组,但表现出上升-下降-上升的波动变化特征;盐胁迫导致Hv TIP2;1表达量持续下降,而干旱诱导Hv TIP2;1表达量不断升高,处理24h后表达量迅速下降,低于对照水平。利用PCR方法克隆位于基因编码区上游的启动子序列Hv1310p,该序列含有多个与根特异表达和胁迫响应有关的顺式作用元件。通过5'端缺失法分别构建514bp和1 258bp启动子的融合GUS报告基因表达载体,转基因烟草的GUS活性检测表明两个启动子片段都具有根特异性的启动活性。     

刺葡萄抗白腐病转录因子VdWRKY53基因克隆及表达

利用同源克隆的方法,分别获得‘刺葡萄0943’的转录因子VdWRKY53基因的编码区和启动子区域,分析其序列特征,通过实时荧光定量检测其对白腐病菌侵染和水杨酸诱导的反应,并以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照,分析不同种质中转录因子VdWRKY53基因序列及表达差异。结果表明:‘刺葡萄0943’的VdWRKY53基因,在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列和位点特征,在DNA和氨基酸水平上与‘黑比诺’VvWRKY53有5处差异,这5处氨基酸差异可能造成了其功能的差异;‘刺葡萄0943’和‘黑比诺’中的WRKY53基因启动子受葡萄白腐病菌和水杨酸诱导后表达量增加,且VdWRKY53基因表达量和趋势不同于‘黑比诺’VvWRKY53。生物信息学分析和实时荧光定量表明,在‘刺葡萄0943’抗病途径中VdWRKY53转录因子具有重要的生物学作用。     

应用基于粒子群优化的支持向量机算法识别真核生物基因的RNA聚合酶II启动子序列

启动子是调节基因表达的重要元件,对其的研究对于阐明基因转录调控机制具有重要意义。作者依据RNA聚合酶Ⅱ启动子序列特性选取高效的特征提取方法,构建了基于粒子群优化的支持向量机(particle swarm optimization-support vector machine,PSO-SVM)新方法,用以识别真核生物基因RNA聚合酶Ⅱ启动子。结合5-折交叉检验方法,得到启动子-外显子、启动子-内含子和启动子-基因间序列的分类准确率分别为97.1%、96.7%和98.8%,其马修斯相关系数分别为0.962、0.934和0.976。结果说明,对比其它启动子识别方法,PSO-SVM方法更能有效地识别真核生物基因启动子。     

大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较

启动子位于转录起始位点上游并能特异性地结合RNA聚合酶,其作为调控序列驱动外源基因在异源植物中表达,从而实现转基因的高效性,具有时空表达特异性的启动子对获得有效转基因植物及产物具有重要意义。为了解种皮特异启动子的表达模式,该研究基于前期报道的序列,通过同源克隆的方法分别从大麦和油菜中克隆获得Gerb和Bntt两个种皮特异性启动子,并对其进行生物信息学分析,构建了Gerb::GUS和Bntt::GUS植物表达载体并转化拟南芥,通过组织化学染色观察了GUS的表达情况。结果表明:两种启动子序列中都含有多拷贝种皮特异表达启动子元件以及多种胁迫诱导响应元件;转基因拟南芥幼苗期,大麦Gerb种皮特异启动子驱动GUS全株表达且子叶和下胚轴较真叶和根中表达量高;油菜Bntt种皮特异启动子表达较弱;成株期,Gerb在不同组织(叶片、茎、花序和角果)中均有表达,未显示组织特异性;Bntt仅在叶片及角果维管束中有微弱表达。在各种非生物胁迫下,Gerb表达模式未发生显著变化,而Bntt仅在盐胁迫下显示很强的角果和种子特异性表达,其他胁迫未见明显表达。以上结果显示,大麦种皮特异性启动子Gerb和油菜种皮特异性启动子Bntt在时间和空间表达模式上存在差异,这对今后选择种皮特异启动子具有参考作用,但其具体机制仍需进一步研究验证。     

产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆及功能分析

采用基于热不对称交错式PCR的基因组步移法,从藤稔葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的基因组总DNA中扩增花发育相关基因FT、FLC、AP3和AG的启动子上游序列片段,并通过序列分析及PlantCARE在线预测对FT、FLC和AP3启动子片段的序列及顺式调控作用元件和功能进行了分析.扩增结果表明:AG的第1轮扩增产物无明显条带,第2轮扩增产物条带弥散,不能用于序列分析及顺式调控作用元件和功能分析;FT、FLC和AP3基因2轮扩增产物均有特异条带,FT、FLC和AP3启动子序列的实际长度分别为1 470、1 698和1 061 bp,GenBank登录号分别为HM192806、HM192805和HM192804.PlantCARE在线预测结果表明:FT、FLC和AP3启动子片段中均含有TATA-box、CAAT-box等启动子的特异表达元件及光响应元件、真菌刺激响应元件、MYB结合位点等多个顺式调控作用元件,共同受真菌刺激、MYB和光等因素的调控;FT、FLC和AP3均可能在花的分生组织中表达,且FT和AP3还可能在胚乳中表达.根据研究结果推测:FT、FLC和AP3基因的启动子序列片段中均存在多种诱导响应元件,可能均为诱导型启动子.     

利用DNA池技术研究猪GH基因启动子序列的多态性

目的:分析猪GH基因启动子区序列的多态性,期望筛选出对猪生长性状有显著影响的SNP位点,为地方猪种的选育及选种提供一定的理论依据.方法:以大约克、可乐猪、香猪和黔北黑猪为试验对象,构建品种DNA池,采用PCR产物直接测序法对猪GH基因启动子区-856～+171片段共1 027bp进行单核苷酸多态性检测.结果:除香猪外,在其他3个猪种5'-端侧翼序列发现5个SNP位点:C22T、A- 26T、G- 219A、T- 385A和C-391T,并且在大约克GH基因启动子区-640处发现了一个12bp碱基序列(GGCAAAGTGTAG)的缺失.结论:DNA池结合PCR产物直接测序技术能够很好的筛选SNP位点,本研究采用该技术在猪GH基因启动子区- 856～+171片段检测到了5个SNP位点.     

马铃薯块茎组织特异性启动子的克隆及序列分析

利用PCR技术从马铃薯陇薯3号基因组DNA中扩增出长度约为1.0 kb的DNA片段,经与T载体连接,测序表明,克隆到的DNA片段大小为969 bp,该序列与GenBank中已公布的patatin启动子序列同源性为97.94％;采用植物顺式调控元件数据库PLACE和PlantCare进行序列分析,结果表明,该片段含有启动子的保守序列TATA-box和CAAT-box,且在CAAT-box上游有8 bp的增强子.此外,还具有马铃薯块茎蛋白patatin基因启动子保守调控序列的蔗糖效应元件(SURE)4个及马铃薯储藏物特异结合调控patatin蛋白表达位点(B-box)2个,而这些特异序列可能是基因特异表达所必须的.     

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1912 bp的启动子(AGPasep)序列.该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子.为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达.GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能.