枯草芽孢杆菌中一种新型双向启动子的功能鉴定

本研究旨在通过转录组分析预测的方法,由地衣芽孢杆菌中筛选获得一种新型双向启动子,鉴定其启动强度。以已知强组成型启动子pShuttle-09为对照,检测其对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达活性。成功构建了3种重组碱性蛋白酶表达载体及对应的工程菌株。在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下,克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164 U/mL和111 U/mL。结果表明,pLA的启动强度明显高于pShuttle-09和pLB,pLA启动子与pLB启动子均可表达碱性蛋白酶。从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向,也为原核生物中共同表达两种基因提供了新的思路。     

北极狐β-防御素103基因 (CBD103) 启动子活性及转录调控元件分析

本研究旨在筛选调控北极狐毛色基因CBD103的启动子活性区域及转录因子结合位点,为揭示CBD103基因调控北极狐毛色形成的分子遗传机制提供依据。克隆获得了北极狐CBD103基因5′侧翼区2 123 bp的片段,并构建了4个不同长度的启动子缺失片段表达载体,通过双荧光素酶检测系统对启动子活性进行检测。对启动子活性最高区域预测出的3个特异性蛋白1 (Sp1)转录因子结合位点分别进行点突变并构建3个突变载体,利用双荧光素酶检测系统测定其活性。结果显示,在构建的4个不同长度启动子缺失片段中1 656 (-1 604/+51)区域活性最高,在此区域构建的3个突变载体的启动子活性较野生型(片段1 656)均显著降低,说明-1 604/+51区域为北极狐CBD103基因的核心启动子区,-1 552/-1 564、-1 439/-1 454和-329/-339区域为正调控区域。文中成功获得了北极狐CBD103基因的核心启动子区域和正调控区域,这为进一步研究该基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制奠定了基础。     

两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响

背景:碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种具有广泛用途的工业酶制剂,其发酵活力目前仍不能满足工业生产需要。目的:旨在通过优化启动子及其组合来提高Bacillus subtilis WB600中碱性蛋白酶AprE的产量。方法:以Bacillus subtilis WB600为出发菌株,成功构建了含有4种不同类型启动子(P1、P2、P-1-2、P-2-1)的碱性蛋白酶AprE表达菌株。结果:含不同启动子的4株重组菌均可成功表达碱性蛋白酶,发酵48h,含单一启动子P2的重组菌株表达碱性蛋白酶的活力为4 041U/ml,是P1的1. 23倍。双启动子重组菌B. subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高,是双启动子P-1-2的1. 35倍,达到了6 125U/ml。结论:为工业化高产碱性蛋白酶提供了一种有效策略。     

通过优化表达元件及培养基组分提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量

【背景】碱性丝氨酸蛋白酶(Subtilisin)是一种具有广泛用途的工业酶制剂。【目的】旨在通过优化启动子、信号肽及培养基组分来提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量。【方法】以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株,构建了含有4种不同类型启动子(PbacA、P43、PaprE和PsrfA)及4种不同类型信号肽(SPVpr、SPSacB、SPSacC和SPAprE)的碱性丝氨酸蛋白酶表达菌株,并在获得高产菌株的基础上进行培养基优化。【结果】4种启动子的表达水平为PbacAPaprEP43PsrfA,4种信号肽的分泌效率为SPAprESPSacCSPSacBSPVpr。其中,菌株BL10/pPbacA-aprE产生最高的碱性丝氨酸蛋白酶酶活(275.21 U/mL),相比于出发菌株BL10/pHY-aprE (167.98 U/mL)提高了64%。随后,通过对发酵培养基成分进行优化并结合正交优化,获得了一种高产碱性丝氨酸蛋白酶的培养基(g/L):玉米淀粉40.0,豆粕50.0,(NH4)2SO4 4.0,K2HPO4 3.0,CaCO3 1.0。最后,碱性丝氨酸蛋白酶酶活提高到747.37 U/mL,是初始酶活的4.45倍。【结论】为工业化高产碱性丝氨酸蛋白酶提供了一种有效策略。     

拟南芥γ-生育酚甲基转移酶 （γ-TMT）启动子的分离及表达特性分

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。Γ-生育酚甲基转移酶（γTMT）是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。     

植物性转基因食品的检测与验证方法

厦门大学生命科学学院刘光明、宋思扬、龙敏南等6位科研人员根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子（CaMV35S）和根癌农杆菌终止子（NOS）的序列。设计并合成了两对不同的引物,建立了PCR-酶切分-Soutllem杂交检测并确定认为转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法,并用此法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行检测,发现13份样品中有6份检出35S启动子和NOS终止子,7份样品结果为阴性。     

人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究

3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF 3a 和ORF 7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。     

大豆β-伴大豆球蛋白基因启动子的克隆及功能分析

通过PCR技术从三个栽培大豆（南农99-10、N2899和南农88－1）和两个野生大豆（江浦野生豆－1和ZYD4174）的基因组中分离到大豆7S蛋白α亚基基因启动子片段(7SαP),序列分析表明：7SαP片段包含多个种子特异性启动子所特有的序列元件,如RY重复序列、ACGT、AGCCCCA等,而这五个大豆材料的7SαP序列的同源性达99%。将从南农99-10中克隆的启动子片段与pBI121-GFP连接构建表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥。Southern结果显示, 7SαP 片段和报告基因GFP以单拷贝的形式整合到拟南芥基因组中,且GFP在7SαP驱动下获得了种子特异性表达。     

一种基于多特征的大肠杆菌启动子判别算法

主要对从一段DNA序列中提取出信息以判别其中是否含有启动子的问题进行了研究。首先从固定长度的序歹4中提取成分特征和结构特征,然后将这些特征输入到一个非线性分类器中进行判别。测试结果显示,在正集＆非编码区负集中,平均错误率降低为13．4％;在正集＆编码区负集中,平均错误率降低到17．0％。表明该方法是非常有效的。     

84K杨PagC3H3基因表达模式分析

木质素作为木材的主要组成成分,通常是由3种单体聚合而成,在其生物合成过程中,共有10个酶家族参与负责将苯丙胺酸转化为单体木质素,其中C3H是在对-香豆酰辅酶A（p-coumaroyl CoA）到咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA）的羟基化过程和G/S单体形成中的关键控制酶类,探究PagC3H3基因表达模式,对于进一步了解该基因功能具有重要意义。该研究通过定量PCR对PagC3H3基因的组织特异性表达进行分析;克隆得到了长度为2 035 bp的PagC3H3的启动子序列,预测含有多个顺式作用元件;同时,将获得的PagC3H3的启动子序列构建植物表达载体pBI121-PagC3H3pro：：GUS,进行拟南芥瞬时转化,结果显示PagC3H3基因在84K杨的根、中部茎节和基部茎节中的表达量较高;瞬时转化拟南芥,GUS染色表明：在下胚轴和根中GUS活性较强,由此推测PagC3H3基因在木质素合成过程中发挥作用。