玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

草莓MET1基因启动子克隆及瞬时表达分析

根据草莓MET1类DNA甲基转移酶基因(FaMET1)全长序列设计引物,通过PCR获得了该基因翻译起始位点上游669 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列中存在启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box和多个胁迫诱导元件.进一步构建了FaMET1基因启动子驱动GUS的植物表达载体FMpro::GUS,通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,结果表明,该序列能够驱动GUS在草莓果实中瞬时表达,为进一步研究FaMET1的表达调控奠定了基础.     

拟南芥生长素受体基因TIR1启动子的克隆及序列分析

以野生型拟南芥 (Arabidopsis Columbia)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到拟南芥生长素受体基因TIR1启动子2008片段,将该片断克隆到PGM-T载体上.序列分析表明,该启动子大小为2008bp,RNA聚合酶识别序列TATA-box,TIR1特异表达和增强序列CAAT-box皆完整,与已报道的序列比较仅有3个核苷酸发生改变,同源性为99.85%.将该启动子与GUS基因融合,构建成表达载体后,在拟南芥和烟草叶片中做瞬时表达,结果分析显示:拟南芥和烟草叶片中均有GUS 酶活性存在.     

甘蔗ScMOC1基因启动子的克隆与瞬时表达分析

MOC1属于植物特有的GRAS家族蛋白基因,是调控植物腋芽形成发育的关键基因。启动子对基因转录效率起直接调控作用,其功能分析可以精确定位基因的表达部位、发育阶段和调控机制,克隆甘蔗腋芽形成发育关键基因ScMOC1的启动子序列,研究其功能对该基因表达调控机制具有重要意义。本研究以我国主栽甘蔗品种新台糖22号(ROC22)的基因组DNA为模板,通过基因组步移和巢式PCR技术克隆到ScMOC1起始密码子ATG上游1874 bp的启动子序列。PlantCARE在线分析预测表明,该序列包含多个真核生物启动子必需的核心元件TATA-box、CAAT-box以及与光响应、激素响应和分生组织表达等相关的顺式作用元件,推测ScMOC1启动子可通过激素诱导调控ScMOC1表达,且该启动子可能通过分生组织表达顺式调控元件CAT-box参与ScMOC1对甘蔗分蘖的调控。将获得的启动子序列替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达进行活性分析,结果表明:本研究克隆的启动子片段能驱动GUS基因在甘蔗嫩叶中瞬时表达。5′缺失分析表明该启动子的基础启动子序列在起始密码子ATG上游350～500 bp之间。该结果为后续ScMOC1的调控机制研究奠定了良好的基础。     

藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆及功能分析

采用基于热不对称交错式PCR的基因组步移法,从藤稔葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的基因组总DNA中扩增花发育相关基因FT、FLC、AP3和AG的启动子上游序列片段,并通过序列分析及PlantCARE在线预测对FT、FLC和AP3启动子片段的序列及顺式调控作用元件和功能进行了分析.扩增结果表明:AG的第1轮扩增产物无明显条带,第2轮扩增产物条带弥散,不能用于序列分析及顺式调控作用元件和功能分析;FT、FLC和AP3基因2轮扩增产物均有特异条带,FT、FLC和AP3启动子序列的实际长度分别为1 470、1 698和1 061 bp,GenBank登录号分别为HM192806、HM192805和HM192804.PlantCARE在线预测结果表明:FT、FLC和AP3启动子片段中均含有TATA-box、CAAT-box等启动子的特异表达元件及光响应元件、真菌刺激响应元件、MYB结合位点等多个顺式调控作用元件,共同受真菌刺激、MYB和光等因素的调控;FT、FLC和AP3均可能在花的分生组织中表达,且FT和AP3还可能在胚乳中表达.根据研究结果推测:FT、FLC和AP3基因的启动子序列片段中均存在多种诱导响应元件,可能均为诱导型启动子.     

苦瓜中与AGAMOUS相似基因启动子的克隆和表达载体的构建

McAG2基因是苦瓜中分离得到的与AGAMOUS相似基因,在花器官和果实中特异表达,参与花的第三轮和第四轮器官的形成.文章采用染色体DNA步移技术克隆得到长为1 417 bp的McAG2基因5'上游片段.序列分析显示此片段含有典型的TATA-box、CAAT-box、丰富的激素应答调控元件.为了研究这些调控元件,还构建了McAG2基因5'侧翼缺失和内含子缺失表达载体.     

马铃薯classⅠpatatin基因家族的一个新亚型

马铃薯class Ⅰ与classⅡ patatin基因是具有不同组织表达专一性的一个多基因家族。用马铃薯classⅡ patatin启动子为探针,从中国马铃薯(Solanum tuberosum)栽培品种“东农303”基因文库中筛选到一个classⅠpatatin基因。测定其DNA顺序1.8kb;它包括patatin基因5′侧翼区1407bD、结构基因363bp。根据5′端非翻译区顺序,它属classⅠpatatin基因。该基因的5′侧翼区同已报道6种classⅠpatatin基因亚型5′侧翼区之间存在较大片段的缺失与插入,它可能是一新的classⅠpatatin亚型。     

拟南芥生长素受体基因TIRl启动子的克隆及序列分析

以野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到拟南芥生长素受体基因TIRI启动子2008片段,将该片断克隆到PGM-T载体上。序列分析表明,该启动子大小为2008bp,RNA聚合酶识别序列TATA-box,TIR1特异表达和增强序列CAAT-box皆完整,与已报道的序列比较仅有3个核苷酸发生改变,同源性为99．85％。将该启动子与GUS基因融合,构建成表达载体后,在拟南芥和烟草叶片中做瞬时表达,结果分析显示：拟南芥和烟草叶片中均有GUS酶活性存在。     

橡胶树转录因子HbWRKY9的克隆与特性分析

通过RACE技术克隆得到一个新的橡胶树WRKY,命名为Hb WRKY9,Gen Bank登录号为JQ914653,基因全长为1 646 bp,ORF为954 bp,编码317个氨基酸。Hb WRKY9蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,与蓖麻(Ricinus communis)、麻疯树(Jatropha carcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)和酿酒葡萄(Vitis vinifera)的WRKY成员一致性分别为80%、79%、70%和63%。对其启动子序列的分析表明,启动子核心区域位于翻译起始密码子上游74~123 bp处,启动子序列中包含TATA-box、CAAT-box、5'UTR Py-rich stretch、WRKY转录因子结合位点W-box、MYB结合位点MBS,以及与光响应相关的调控元件G-box和Box4,分生组织特异表达调控元件CCGTCC-box,与缺氧诱导相关的ARE元件,与高温胁迫相关的调控元件HSE,与Me JA和ABA等激素响应相关的CGTCA-motif和ABRE等顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,Hb WRKY9基因能响应低温胁迫,呈上调表达。     

拟南芥干旱诱导型启动子RD29A驱动花生AhNCED1基因双元表达载体的构建

从拟南芥基因组中克隆RD29A基因5'-侧翼520bp启动子区域序列,生物信息学分析表明,该启动子片段中存在脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA响应元件(ABRE)、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1。