莱芜猪和杜洛克猪肌肉肌球蛋白重链组成对肉质性状的影响

为探讨莱芜猪肌肉肌球蛋白重链(MyHC)慢速氧化型(Ⅰ)、快速氧化型(Ⅱa)、中间型(Ⅱx)、快速酵解型(Ⅱb)组成与肉质性状间的关系, 阐释莱芜猪肉质优良的机理. 本实验在评价肉质性状的基础上, 用荧光定量RT-PCR方法检测莱芜猪和杜洛克猪背最长肌和半膜肌MyHC 4种亚型mRNA的表达量, 并进行相关分析. 结果表明, 莱芜猪背最长肌和半膜肌MyHCⅡa, Ⅱx mRNA表达量显著高于杜洛克猪, MyHC Ⅱb mRNA表达量则显著低于杜洛克猪, 而MyHCⅠmRNA表达量无明显变化. MyHCⅠ, Ⅱa, Ⅱx mRNA表达量与肉色、pH、大理石纹、肌内脂肪含量正相关, 与嫩度剪切值和肌纤维直径负相关; MyHC Ⅱb mRNA的表达量与大理石纹和肌内脂肪含量显著负相关(P<0.05), 与嫩度剪切值极显著正相关(P<0.01), 与肌纤维直径正相关(P>0.05). 由此可见, MyHCⅠ, Ⅱa, Ⅱx, Ⅱb的组成影响肉质性状, 而且其mRNA的表达量与肉质性状, 尤其是与肌肉食用品质显著相关, 也就是说MyHC 4种亚型的mRNA表达量可准确、客观评价肉质.     

FoxO1抑制猪骨骼肌MyHC Ⅰ的表达

为研究FoxO1与骨骼肌纤维类型之间的关系,本试验以大白猪为实验材料,利用RT-PCR和Western印迹技术,检测了FoxO1与肌纤维类型标志基因MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx在特定骨骼肌中的表达规律,以及调控肌纤维类型关键基因Mef2c和NFAT的表达,并用Wortmannin处理原代培养的猪骨骼肌成肌细胞,检测了FoxO1与肌纤维类型相关基因的表达.结果显示,FoxO1在不同骨骼肌类型中mRNA表达差异不显著(P0.05),其蛋白表达与MyHC各亚型显著相关.Wortmannin处理结果显示,在处理的第3和5d,FoxO1蛋白与MyHCⅡb,MyHCⅡx和NFAT表达显著正相关,而与MyHCⅠ,MyHCⅡa和Mef2c表达显著负相关.结果表明,FoxO1通过抑制MyHCⅠ的表达调控肌纤维类型.     

八眉猪、长白猪及长×八杂交猪肌肉组织中FoxO1基因的表达

分别取6月龄八眉、长白和 (长×八)杂交猪后腿部比目鱼肌、腓肠肌和趾长伸肌, 提取总RNA, 根据人、黑猩猩及大鼠等物种FoxO1基因同源序列设计并合成引物, 以猪b-actin 基因作为内参, 优化反应条件和体系, RT-PCR 单管扩增猪FoxO1基因, 检测八眉、长白和长×八杂交猪不同类型骨骼肌中FoxO1基因mRNA的表达差异。结果表明: 在不同经济类型猪群和不同类型骨骼肌中FoxO1基因mRNA的表达丰度不同, 即在八眉 猪骨骼肌中的表达普遍高于长白猪 (P<0.01), 在杂交组合 (长×八)骨骼肌中的表达也高于长白猪 (P<0.01); 同时在以Ⅰ型纤维为主的比目鱼肌中表达丰度最低(P<0.01), 在以Ⅱb型纤维为主的趾长伸肌中表达丰度最高(P<0.01)。结果提示, FoxO1基因的表达与Ⅰ型肌纤维的含量成反比; 不同经济类型猪品种骨骼肌的发育与FoxO1基因的调控有关。     

调控骨骼肌纤维类型转化的信号通路

骨骼肌由异质性的肌纤维组成,不同类型的肌纤维具有不同的形态、代谢、生理和生化特性.根据不同肌纤维中表达的特异肌球蛋白重链亚型可将成体哺乳动物骨骼肌纤维分为4类,即Ⅰ,Ⅱa,Ⅱx和Ⅱb型.骨骼肌保持高度可塑性,当机体受到某些生理或病理刺激时,骨骼肌为了适应需要,通过激活胞内相关信号通路改变肌纤维特异基因的表达从而诱发肌纤维类型的转化.本文综述了细胞内参与调控肌纤维类型转化的多条重要信号通路,如Ca2+信号通路,Ras/MAPK信号通路及多种转录调节因子,辅激活因子和抑制子等,为改善肉类品质,提高运动训练效果及治疗肌肉相关疾病奠定了理论基础.     

猪FSH β亚基基因结构区Alu序列插入突变的研究

通过聚合酶链式反应（PCR）对中国华北型优良地方猪种莱芜猪及杜里猪,长白猪的卵泡刺激素（FSH）β亚基基因结构区插入片段进行扩增,并对0．5kb扩增产物进行克隆和测序,序列分析表明,在已发表的猪FSHβ亚基基因全序列的＋809和＋810碱基之间,莱芜猪,杜里猪和长白猪分别存在一个长度为275,277和274bp的插入片段,插入片段末端的poly(A)分别为17,19和16个腺苷酸,均显著短于高产猪种太湖猪（292bp和32个腺苷酸）,对FSHβ亚基基因插入片段进行BamHI多态性分析,发现本研究所检测样品中不存在BamHI 多态性,插入片段中存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及AluI内切酶识别位点,所以该睡段可能为Alu成分,因RNA聚合酶Ⅲ这种有功能的内部启动子能够转录相邻的染色体序列,该插入片段可能影响FSHβ亚基基因或其他基因的表达调控,把FSHβ亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的候选基因与产仔数进行连锁分析,证明FSHβ基因因座在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优质基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎产仔1．2头,因不同品种猪插入序列的主要差异是末端的poly(A)长短不同,推测该插入片段末端的pol(A)结构亦可能影响猪的产仔数。     

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实. 然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入3个E-box序列, 构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子. 然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达. 结果表明, 在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及 SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组（P＜0.01）; 而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组（P＜0.01); 在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P＞0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.     

猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达及对肌球蛋白重链基因表达的影响

猪CFL2b基因主要在骨骼肌中表达,对肌肉的发育和肌纤维的形成具有一定作用。为了解猪CFL2b基因与肌纤维性状的相关性,利用定向克隆和基因转染技术获得能稳定表达猪CFL2b基因的成肌细胞株,荧光显微镜观察及Western Blotting检测CFL2b基因在成肌细胞中的表达;应用实时定量PCR技术对细胞内肌球蛋白重链基因（MyHC）的表达变化进行检测。结果显示：CFL2b基因对MyHC的表达有明显影响,其中MyHC2x基因和MyHC26基因的表达明显上调,MyHCl／slow的表达变化不明显。表明CFL2b基因与猪的肌纤维性状密切相关,推测猪CFL2b基因的高表达可能导致猪的不良肉质性状,可以考虑将CFL2b基因作为猪肉质性状的候选基因[动物学报54（6）：1014—1019,2008]。     

不同强度运动对骨骼肌纤维MHC亚型转化及CaN/NFATc1信号通路的影响

目的：研究不同强度运动对骨骼肌纤维MHC亚型转化及钙调神经磷酸酶（CaN）/活化T细胞核因子1（NFATc1）信号通路的影响。方法：雄性SD大鼠（2月龄）24只,随机分为3组（n=8）：正常对照组（NC）、中等强度组（ME）、大强度组（HE）,进行8周跑台训练。采用ATP酶染色法测定I、Ⅱ型肌纤维,凝胶电泳技术分离肌球蛋白重链（MHC）亚型,比色法测定骨骼肌中CaN活性,免疫印迹技术测定骨骼肌NFATc1蛋白含量。结果：①肌纤维密度变化：股四头肌ME组I、Ⅱ型纤维数密度均显著增加（P<0.05）,HE组仅Ⅱ型纤维面密度显著增加（P<0.05）;比目鱼肌HE、ME组I型纤维数密度均显著增加（P<0.05）;②肌纤维MHC亚型百分比变化：股四头肌ME组MHCI、Ⅱa百分比升高（P<0.05）,而MHCⅡb百分比降低（P<0.05）;比目鱼肌MHCI百分比升高,MHCⅡa、Ⅱb百分比降低;③ME组大鼠CaN活性、NFAT1蛋白含量均显著升高（P<0.05）。结论：大、中等强度运动可诱导骨骼肌MHC快型向慢型转化,同时伴随肌纤维亚型变化骨骼肌中CaN活性增加、NFATc1蛋白表达增加。     

猪CAST基因的单核苷酸多态性及其对肉质性状的效应

CAST基因作为肉质性状的主要候选基因.以80头外来猪和190头地方猪为材料,在CAST基因内含子24上检测到两个多态性位点(A916G 和C1633G ).在916位点上,长白猪和大白猪以A基因为优势基因,其频率分别为0.88和1.00;莱芜猪,大薄莲猪,沂蒙黑猪和里岔黑猪以B基因为优势基因,其频率分别为0.93, 0.97, 0.78和0.68.在1633位点上,长白猪和大白猪以C基因为优势基因,其频率分别为0.82和0.79:莱芜猪,大薄莲猪,沂蒙黑猪和里岔黑猪以D基因为优势基因,其频率分别为1.00, 1.00, 0.88, 0.78.在试验猪种中,共检测到6种单倍型(AACC,AACD,AADD,ABCC,BBCC,BBDD).单倍型分布的多重比较结果表明,外来猪种(长白猪和大白猪)与地方猪种(莱芜猪,大薄莲猪,沂蒙黑猪和里岔黑猪)比较差异极显著(P < 0.01).固定效应模型分析结果表明,嫩度,屠宰45 min后pH值和滴水损失单倍型间差异显著(P < 0.05).最小二乘分析结果表明,外来猪种与地方猪种在嫩度,屠宰45 min后pH值和滴水损失间差异显著(P < 0.05).BBDD单倍型个体与其它单倍型个体比较,嫩度及滴水损失差异显著(P < 0.05);AADD,BBCC,BBDD单倍型个体与其它单倍型个体比较,屠宰45 min后pH值差异显著(P < 0.05).因此,在育种过程中将CAST基因应用于标记辅助选择,将有利于改善猪肉品质,加快育种进程.     

猪CFL2b 基因cDNA克隆初步分析

利用基因表达谱芯片分析法筛选出与大白猪高肌肉产量-肌纤维形成有关的CFL2b基因.参考人和小鼠CFL2b基因序列,采用SMART-RACE技术结合EST序列拼接技术,从猪骨骼肌肌肉中首次克隆了猪CFL2b的全长cDNA序列（GenBank登录号EU561660,EU561661）,Northern杂交检测CFL2b基因 mRNA.结果表明,猪CFL2b基因含有2个转录本,长转录本3　012 bp,短转录本1　466 bp .CFL2b基因在多种真核生物中都有表达,且编码区序列非常保守,开放式读码框501 bp编码了166个氨基酸的蛋白质.氨基酸序列分析表明,猪CFL2基因与人和小鼠氨基酸同源性分别为100%和99.1%.核苷酸序列相似性分别为88.1%和74.9%.     

猪PID1基因CDS区的克隆及其mRNA表达与肌内脂肪沉积关系

为了探索PID1(Phosphotyrosine interaction domain containing1)基因的表达与脂肪沉积的关系,文章利用兼并引物进行RT-PCR从猪脂肪和肌肉组织中克隆PID1基因CDS(Coding region)区全序列,并采用荧光定量PCR方法对大白猪、鲁莱黑猪、莱芜猪3个猪品种的肝脏、脂肪和肌肉组织PID1基因mRNA表达进行了相对定量分析。结果表明:经克隆、测序,得到了猪PID1基因654bp全编码区序列,通过Blast比对,与人、大鼠、牛有93.88%、66.94%、88.07%的同源性。PID1基因在同一个品种猪中mRNA表达水平总体表现为:肝脏脂肪肌肉。在不同品种3种组织中PID1基因mRNA表达水平总体表现为:莱芜猪鲁莱黑猪大白猪,其中肝脏中差异显著(P0.05),但是在脂肪和肌肉组织中莱芜猪与鲁莱黑猪差异不显著(P0.05)。对于高肌内脂肪(LWH)、中等肌内脂肪(LWI)和低肌内脂肪(LWL)沉积的3组莱芜猪,PID1基因在肝脏组织中的表达水平是LWH显著高于LWL(P0.05),在肌肉组织中则是LWH显著高于LWI和LWL(P0.05)。PID1基因在莱芜猪品种内3个组织中mRNA表达量与IMF含量相关均不显著,而在品种间3个组织中mRNA表达量与IMF含量呈显著正相关(P0.05)。结果提示:PID1的表达可能与脂肪沉积性状存在一定的关系。     

Effect of myosin heavy chain composition of muscles on meat quality in Laiwu pigs and Duroc

In order to explain the mechanism of high meat quality in Laiwu pigs and investigate the relation between myosin heavy chains (MyHC) composition and meat quality, meat quality analysis was conducted and mRNA expression of MyHC I, IIa, IIx, IIb was quantified by real-time fluorescence PCR in longissimus muscle (LM) and semimembranous muscle of Laiwu pigs and Duroc. The result indicated that, compared with Duroc, mRNA expression of MyHC IIa, IIx in LM and semimembranous muscle of Laiwu pigs was significantly increased, mRNA expression of MyHC IIb was dramatically decreased. However, the expression of MyHC I was not significantly affected by breeds. The correlation between mRNA expression of MyHC I, IIa, IIx in LM and meat color, pH value, marbling, intramuscular fat content was positive, but shear value of LM was negative. The relation between MyHC IIb mRNA expression and marbling, intramuscular fat content was dramatically negative, whereas shear value was strikingly positive, as well as fiber diameter, but without reaching statistical significance. Therefore, the composition of MyHC I, IIa, IIx, IIb affected meat quality, furthermore, expression of MyHC I, IIa, IIx, IIb mRNA prominently influenced meat characteristics, especially edible quality of muscle, suggesting that mRNA expression level of MyHC I, IIa, IIx, IIb can exactly and impersonally estimate meat quality.     

猪背最长肌中肌肉生长和脂肪沉积相关基因的差异表达和主成分分析

骨骼肌细胞和脂肪细胞在分化生长速度上相对竞争的平衡点是猪肉质和胴体性状的决定因素.利用Oligo功能分类芯片检测了瘦肉型的长白猪和脂肪型的太湖猪在初生、1、2、3、4和5月龄间背最长肌中肌肉生长和脂肪沉积相关基因的动态表达变化.差异表达分析结果显示,在初生至5月龄的品种间分别有15、16、11、13、18和20个基因的表达差异倍数大于2倍.品种内的方差分析表明,长白猪分别有18和22个基因,太湖猪分别有3和7个基因在月龄间的表达差异达极显著(Ｐ<0.01)和显著水平(Ｐ<0.05).主成分分析结果显示,先降后升是两品种内最具代表性的基因表达模式,且长白猪和太湖猪分别有7和6个基因的表达模式明显偏离其他基因,提示其可能受到了重要的调控. 此外,5个差异表达基因的荧光定量RT-PCR验证结果均与芯片结果呈正相关趋势.以上结果筛选出了对于猪肉质和胴体性状可能具有重要影响,值得深入研究的一些候选基因,为深入研究生长发育过程中参与肌纤维生长和脂肪酸合成关键基因的表达变化规律和互作调控机制提供了基础数据.     

不同猪品种肌肉组织FoxO1与MyoD基因mRNA的表达及其相关性分析

分别取6月龄八眉猪、长白猪和长×八杂交猪背最长肌,提取总RNA,设计并合成猪FoxO1和MyoD 引物,以β肌动蛋白作为内参,优化反应条件和体系,利用RT-PCR方法检测八眉、长白和长×八杂交猪肌肉组织中FoxO1和MyoD基因mRNA 的表达.结果表明,在不同经济类型猪品种肌肉组织中,FoxO1和MyoD基因mRNA的表达丰度均存在显著差异,FoxO1在八眉猪肌肉组织中的表达普遍高于长白猪（P<0.01）,在杂交组合长×八肌肉组织中的表达也高于长白猪（P<0.01）;而MyoD恰好相反,即在长白猪肌肉组织中的表达普遍高于八眉猪（P<0.01）,在杂交组合长×八肌肉组织中的表达也高于八眉猪（P<0.01）．结果提示,FoxO1和MyoD基因mRNA的表达在肌肉发育中存在负相关（r = 0.728 , P < 0.05）,FoxO1在肌肉组织中的上调作用,可能是造成的MyoD基因mRNA表达降低的原因之一,进而负调控肌肉的发育和骨骼肌的量．     

Expression of the Myosin Heavy Chain IIB Gene in Porcine Skeletal Muscle: The Role of the CArG-Box Promoter Response Element

Due to its similarity to humans, the pig is increasingly being considered as a good animal model for studying a range of human diseases. Despite their physiological similarities, differential expression of the myosin heavy chain (MyHC) IIB gene (MYH4) exists in the skeletal muscles of these species, which is associated with a different muscle phenotype. The expression of different MyHC isoforms is a critical determinant of the contractile and metabolic characteristics of the muscle fibre. We aimed to elucidate whether a genomic mechanism was responsible for the drastically different expression of MYH4 between pigs and humans, thus improving our understanding of the pig as a model for human skeletal muscle research. We utilized approximately 1 kb of the MYH4 promoter from a domestic pig and a human (which do and do not express MYH4, respectively) to elucidate the role of the promoter sequence in regulating the high expression of MYH4 in porcine skeletal muscle. We identified a 3 bp genomic difference within the proximal CArG and E-box region of the MYH4 promoter of pigs and humans that dictates the differential activity of these promoters during myogenesis. Subtle species-specific genomic differences within the CArG-box region caused differential protein-DNA interactions at this site and is likely accountable for the differential MYH4 promoter activity between pigs and humans. We propose that the genomic differences identified herein explain the differential activity of the MYH4 promoter of pigs and humans, which may contribute to the differential expression patterns displayed in these otherwise physiologically similar mammals. Further, we report that both the pig and human MYH4 promoters can be induced by MyoD over-expression, but the capacity to activate the MYH4 promoter is largely influenced by the 3 bp difference located within the CArG-box region of the proximal MYH4 promoter.     

OLFML3 expression is decreased during prenatal muscle development and regulated by microRNA-155 in pigs

The Olfactomedin-like 3 (OLFML3) gene has matrix-related function involved in embryonic development. MicroRNA-155 (miR-155), 21- to 23-nucleotides (nt) noncoding RNA, regulated myogenesis by target mRNA. Our LongSAGE analysis suggested that OLFML3 gene was differently expressed during muscle development in pig. In this study, we cloned the porcine OLFML3 gene and detected its tissues distribution in adult Tongcheng pigs and dynamical expression in developmental skeletal muscle (12 prenatal and 10 postnatal stages) from Landrace (lean-type) and Tongcheng (obese-type) pigs. Subsequently, we analyzed the interaction between OLFML3 and miR-155. The OLFML3 was abundantly expressed in liver and pancreas, moderately in lung, small intestine and placenta, and weakly in other tissues and postnatal muscle. There were different dynamical expression patterns between Landrace and Tongcheng pigs during prenatal skeletal muscle development. The OLFML3 was down-regulated (33-50 days post coitus, dpc), subsequently up-regulated (50-70 dpc), and then down-regulated (70-100 dpc) in Landrace pigs, while in Tongcheng pigs, it was down-regulated (33-50 dpc), subsequently up-regulated (50-55 dpc) and then down-regulated (55-100 dpc). There was higher expression in Tongcheng than Landrace in prenatal muscle from 33 to 60 dpc, and opposite situation from 65 to 100 dpc. Dual luciferase assay and real time PCR documented that OLFML3 expression was regulated by miR-155 at mRNA level. Our research indicated that OLFML3 gene may affect prenatal skeletal muscle development and was regulated by miR-155. These finding will help understanding biological function and expression regulation of OLFML3 gene in mammal animals.