产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

造纸用木聚糖酶的基因工程研究进展

木聚糖酶用于造纸行业可以显著改善纸浆的性能,减少纸张处理过程中有害化学试剂的使用,从而减轻环境污染,提高纸张品质,因此在造纸工业中具有广阔的应用前景。本文从造纸用碱性木聚糖酶基因的克隆、分子改造、高效表达及在造纸行业的应用研究等方面出发,对造纸用碱性木聚糖酶的研究现状进行综述,为开发造纸用木聚糖酶提供了思路。     

D-核糖生产菌株的生长形态变化及快速记录方法

细胞形态和变化是微生物发酵过程中细胞生长和代谢产物合成速率的重要表征因素,该研究以微生物发酵生产D-核糖为研究体系,采用生物显微镜,图形采集器,图形采集软件等,建立了微生物发酵过程中细胞的形态和变化的快速记录方法,并用此方法观察D-核糖生产菌株的生长形态变化。     

途径工程及Tn5转座子介导突变提高大肠杆菌丙酮酸生产

为了开发丙酮酸高产菌株,以大肠杆菌MG1655为出发菌株,通过基因敲除阻断副产物途径构建了产丙酮酸大肠杆菌工程菌KLPP。进一步利用p UT Mini-Tn5载体进行转座子随机突变,构建了含有7 197个单克隆的突变体文库。使用基于丙酮酸的二硝基苯肼显色法,建立了96孔板-酶标仪快速筛选方法,经过两轮的筛选,成功筛选到了6个突变体菌株,比KLPP丙酮酸产量提高了38%、31%、19%、28%、44%和14%。利用全基因组重测序确定了其转座子插入的位置,进而确定了可能影响丙酮酸产量的基因位点,为后续菌株改造工作奠定了基础。     

代谢工程改造大肠杆菌生产水杨酸葡萄糖苷

水杨酸葡萄糖苷(salicylate 2-O-β-D-glucoside,SAG),是植物中水杨酸的一种存在形式。水杨酸葡萄糖苷也具有消炎止痛的作用,和水杨酸、阿司匹林对比,表现出更小的刺激性,是一种具有潜力的消炎护肤物质。通过生物法利用可再生资源进行水杨酸类物质的生产方式,与传统工业法生产相比对环境更加友好。本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)Tyr002作为出发菌株,引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)异分支酸裂解酶基因pchB,首先构建了大肠杆菌水杨酸生产菌株。通过调控下游不同芳香族氨基酸代谢途径关键基因表达,菌株摇瓶发酵水杨酸产量达到1.05 g/L。之后,通过在水杨酸生产菌株中引入植物来源水杨酸糖基转移酶,对水杨酸进行糖苷化修饰。新构建的菌株摇瓶发酵水杨酸葡萄糖苷产量达到5.7 g/L。在5 L发酵罐分批补料发酵中,水杨酸葡萄糖苷的产量达到36.5 g/L,是目前报道的最高产量。本研究为水杨酸类化合物的微生物合成提供了重要参考。     

芳香族化合物微生物代谢工程研究进展

代谢工程从20世纪90年代初期发展至今已有近30年历史,对微生物菌种改良和选育工作起到了极大的推动作用。芳香族化合物是一类可以通过微生物发酵生产的化学品,广泛应用于医药、食品、饲料和材料等领域。利用代谢工程手段对莽草酸和芳香族氨基酸合成途径进行理性改造,微生物细胞可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物。笔者对近30年来国内外代谢工程改造微生物合成各种芳香族化合物的研究策略和生物合成途径进行了梳理和总结,以期为开展相关研究提供参考。     

产顺,顺-粘康酸细胞工厂的构建与优化

顺,顺-粘康酸是重要的平台化学品。目前,生物合成顺,顺-粘康酸还缺乏高性能菌株,已报道的主要工程菌株不仅需要诱导表达,遗传不稳定,而且发酵培养基组分复杂,不利于大规模工业化生产。构建能利用简单无机盐培养基、遗传稳定且不需要诱导表达的新型工程菌受到人们的关注。本研究在实验室前期构建的产三脱氢莽草酸工程菌株WJ060中,整合合成顺,顺-粘康酸的3个外源基因(aro Z、aro Y、cat A),并且利用3个不同强度的组成型启动子进行组合调控,成功构建了27株顺,顺-粘康酸工程菌,得到的最优工程菌MA30的产量达到1.7 g/L。为了进一步提高顺,顺-粘康酸工程菌的生产能力,利用基因组复制工程构建突变体库,结合高通量筛选方法,经过两轮筛选,成功筛选到了顺,顺-粘康酸产量提高超过8%的大肠杆菌MA30-G2。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵,MA30-G2的顺,顺-粘康酸产量达到了11.5 g/L。本研究采用组合调控和高通量筛选相结合的策略不仅促进了顺,顺-粘康酸的生物合成,同时也为其他生物基化学品的生物制造提供了重要参考。