芜菁类黄酮3′-羟化酶基因的功能鉴定及启动子初步分析

类黄酮3′-羟化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H）是细胞色素P450单加氧酶,在花青素合成途径中催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素,进而形成矢车菊色素。利用津田芜菁BrF3′H1和赤丸芜菁BrF3′H2基因构建过量表达载体后遗传转化烟草,转基因植株的花色加深。通过染色体步移法克隆了BrF3′H1和BrF3′H2基因上游846和851 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P均包含TATA box、CAAT box、光调控元件、MRE、ABRE、ATGCAAAT-motif、ERE、O2-site、RY-element、LTR等多个顺式作用元件;二者的核苷酸序列在7个位点存在差异。利用BrF3′H1P和BrF3′H2P序列替换pCAMBIA1301植物表达载体的35S启动子后遗传转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P序列均能驱动GUS基因表达。通过PCR方法获得了BrF3′H1P和BrF3′H2P的一系列缺失片段,融合GUS基因后转化烟草。染色结果显示,BrF3′H1P和BrF3′H2P系列缺失片段均具有起始GUS基因表达的活性。BrF3′H1和BrF3′H2基因的功能鉴定及启动子的初步分析将为揭示津田芜菁和赤丸芜菁F3′H基因的光诱导表达调控机理奠定研究基础。     

小麦细胞增殖核抗原基因启动子的克隆及活性分析

细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）基因是DNA聚合酶δ的辅助因子,在真核细胞DNA复制及其损伤修复中发挥着重要的作用.采用高效热不对称交互PCR法（high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,hiTAIL PCR）从小麦西农1 376基因组中扩增得到小麦PCNA基因启动子片段,并命名为TaPCNA启动子. PlantCARE启动子在线分析软件预测含有光应答调控元件（Box I）、脱落酸应答元件（ABRE）、花粉发育应答元件（GGTT motif,GTGA motif）及细胞周期转换结合位点（E2F-binding site）等.为了分析其启动子活性, 通过替换pBI121载体上的CaMV35S启动子,构建了TaPCNA启动子与β-葡糖醛酸酶（GUS）基因的融合表达载体,通过农杆菌介导法在烟草叶片中进行瞬时表达. GUS组织化学染色结果表明,TaPCNA基因启动子能够驱动GUS基因在烟草叶片中表达,证实了所获得的启动子序列具有启动活性.本研究通过hiTAIL-PCR法克隆得到TaPCNA基因的启动子,为深入研究该基因的功能奠定了基础.     

苦荞查尔酮合酶基因FtCHS1启动子的克隆及分析

采用染色体步移技术,从苦荞（Fagopyrum tataricum Gaertn.）中克隆获得FtCHS1基因5'端侧翼序列,共1038 bp,将其命名为P_FtCHS1。生物信息学分析表明,P_FtCHS1中A/T碱基含量为63.5%,含有4个可能的转录起始位点,分别位于起始密码子上游-684~-734、-692~-742、-920~-970、-929~-979 bp处,该序列包含TATA-Box和CAAT-Box等启动子核心元件以及与光、低温和激素应答等相关的功能元件。本研究进一步构建了P_FtCHS1-pBI101植物表达载体,并瞬时转化拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）叶片,结果显示该序列可驱动GUS报告基因的表达。低温（4℃）和光照（UV-B）处理苦荞幼芽后,采用荧光定量PCR技术分析FtCHS1基因的表达量,结果表明P_FtCHS1可响应低温和紫外环境胁迫,从而引起FtCHS1基因表达量发生变化。     

兽疫链球菌透明质酸合成相关基因hasB的克隆以及性质研究

透明质酸是链球菌荚膜的主要组成部分,有着重要的生理功能。UDP-葡萄糖脱氢酶(HasB)是透明质酸合成中的一个关键酶,而C类链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因(hasB)尚未被克隆。通过hasB基因的上下游序列设计引物从兽疫链球茵的基因组中克隆出一段序列,测序结果显示其包含一个由1206个碱基组成的开放阅读框,所编码的蛋白序列同化脓链球菌和乳链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶蛋白序列分别有63．1％和70．6％的相似性。将这段基因置于T7启动子下,并在大肠杆菌中进行表达,能够得到一个约47kDa的蛋白,酶活测定显示其具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性。这些结果表明所克隆的基因是兽疫链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因。     

SOEing法在构建人瘦蛋白乳腺表达载体中的应用

目的 :将奶牛CSN2 5′端启动子区与人瘦蛋白cDNA序列进行拼接 ,进而构建人瘦蛋白乳腺特异性表达载体。方法 :设计特殊的“巨型引物” ,运用PCR方法分别从质粒pBBC和pHL上扩增了牛CSN2 5′端启动子 ( 2 8kb)和有完整读码框的人瘦蛋白基因。利用改进的重叠区扩增基因拼接法 (SOEing法 ) ,将两个独立的片断进行了拼接。结果 :得到了两者线形融合基因 ,为构建人瘦蛋白乳腺特异性表达载体打下了基础。     

快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子瞬间表达特性的方法

选择合适的诱导表达启动子是开展植物耐干旱和脱水等非生物逆境转基因研究的重要环节。我们通过几年的研究,已建立了一套以大麦幼苗完整活体和植物离体叶片为主要材料通过瞬间表达鉴定来快速检测干旱和脱水可诱导基因启动子表达特性的方法。来自大麦和水稻的启动子Dhn4s、Dhn8s、HVA1s、Rab16Bj、wsi18j在大麦、小麦、水稻、高粱和蕨类植物的离体叶片中经干燥诱导可以瞬间表达GFP,在绿豆、番茄叶片中不表达。鉴定了HVA1s和wsi18j在大麦不同器官或组织中启动子的定性表达情况。进一步建立了GFP荧光点/GUS染色点计数分析和GUS活性/XYN活性测定分析的启动子表达的定量分析方法,并讨论该方法在环境可诱导植物启动子功能分析中的应用价值和前景。     

拟南芥VHA-c3启动子的GUS基因融合表达

VHA-c3基因是拟南芥液泡H+-ATPase c亚基的5个同源基因之一,已有研究结果表明其与植物抗非生物胁迫有关。本论文在克隆不同长度VHA-c3基因上游调控序列的基础上,利用GUS报告基因,研究了VHA-c3基因的植物组织及器官定位。结果表明：VHA-c3起始密码子上游772bp的序列内存在着VHA-c3基因的基本启动子元件,可指导基因组成型表达在拟南芥的叶片、表皮毛、叶柄、根、雄蕊、柱头和萼片;在VHA-c3起始密码子ATG上游2812bp-2234bp片段和1496bp-772bp片段中各存在一个负调控元件,在2234bp-1496bp片段中存在一个正调控元件,它们的存在可控制基因在气孔中的表达。     

杜氏盐藻rbcS启动子的克隆和功能分析

为提高转基因盐藻的表达效率,利用基因组步行方法和巢式PCR,从盐藻中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的小亚基基因rbcS 的5'上游调控序列,并对其进行序列分析和转基因功能分析。采用Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I四种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA,并与接头连接,构建基因组步行文库GWL 1、GWL 2、GWL 3和GWL 4;设计特异引物从这四种文库中扩增rbcS基因的5'上游调控序列。在GWL 1、GWL 4中分别扩增出约1.2 kb的片段。对该序列的分析表明,它的3'端与已知盐藻rbcS cDNA 的5'端序列完全一致,说明是该基因的5'端上游区,并且包含多个与转录调控有关的保守序列（如TATA-box、CAAT-box）,富含GT的重复序列。此序列EcoR I下游的片段与除草剂抗性基因bar相融合,构建表达载体,电击法转化盐藻。通过对转化藻株的抗性筛选以及PCR和Southern blot检测,表明该区域能驱动外源基因bar在转基因盐藻中的表达,推断是盐藻rbcS基因的启动子调控区。     

不同启动子驱动下转基因盐藻外源基因的稳定表达

摘要：为了探讨外源性与内源性启动子对转基因盐藻外源基因表达的影响,将含外源性启动子CMV35S的表达载体CMV35S-bar（G12）和含内源双拷贝碳酸酐酶启动子DCA1的表达载体DCA1-bar（D-B）分别转化盐藻,筛选稳定转化株后,观察在不同启动子驱动下外源基因的表达情况及对转基因盐藻生长的影响。 通过电击法分别将表达载体G12 和D-B转化盐藻,经PPT筛选后,各得到了3株PPT抗性藻株,经PCR及测序分析证实外源基因bar已经整合到盐藻的基因组中,半定量RT-PCR结果显示,在内源性启动子DCA1驱动下,bar基因的表达强度明显高于在外源性启动子驱动下bar的表达,并且D-B转化株的bar基因表达在盐诱导下其表达明显提高,而G12转化株中bar基因的表达对盐诱导无反应。Southern blot 分析显示,外源基因的拷贝数与不同启动子间无相关性。转化株的生长特性分析显示,D-B转化株的生长速度明显高于G12转化株。本研究的结果指出,内源诱导型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源组成型启动子更具有优势。     

鸡miR-17-92基因簇上游调控区功能分析

miR-17-92基因簇(miR-17-92 cluster)在细胞增殖、分化、凋亡、动物发育以及肿瘤发生等过程中发挥重要作用。目前,人和小鼠等哺乳动物miR-17-92基因簇的转录调控已有深入研究,但该基因簇在鸡等鸟类中的转录调控研究还未见报道,主要原因在于鸟类miR-17-92基因簇上游的基因组序列都存在一个gap,且该基因簇启动子的位置和序列也还不清楚。为此,本研究采用染色体步移的方法获得鸡miR-17-92基因簇上游gap区序列,并采用生物信息学分析和报告基因及截短突变技术开展该gap区的功能分析。染色体步移分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游gap区全长1704 bp,GC含量达80.11%。生物信息学分析显示,鸡miR-17-92基因簇上游gap区内1段200 bp的序列与人、牛、小鼠等9种动物miR-17-92基因簇上游序列保守性较高,且该区域为人和小鼠等哺乳动物miR-17-92基因簇宿主基因的核心启动子区。将克隆的gap区序列插入pGL3 basic荧光素酶报告基因载体,构建成启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)。荧光素酶报告基因活性分析表明,pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)报告基因的活性是pGL3 basic空载体活性的417倍,证明所克隆的gap区片段是鸡miR-17-92基因簇宿主基因的启动子。为进一步分析该启动子的结构和功能,构建gap区片段的5°端缺失突变(缺失448 bp)和3°端缺失突变(缺失894 bp)的荧光素酶报告基因载体。与pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)相比,5°端和3°端缺失突变分别使启动子报告基因活性降低19.82%和60.14%。这些数据提示,鸡miR-17-92基因簇宿主基因启动子的重要调控区位于-3400/-2506。本研究结果为进一步开展鸡miR-17-92基因簇的转录调控奠定了基础。