梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在化学感受系统中的作用, 本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列, 命名为GmolCSP （GenBank 登录号： JQ821389）。序列分析表明, GmolCSP开放阅读框序列为384 bp, 编码127个氨基酸残基, 预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列, 其成熟蛋白的预测分子量为12.80 kD, 等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示, GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、 去触角的头、 胸、 腹、 足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE和Western 印迹检测结果显示, 梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29 kD的融合蛋白, 与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。     

家蝇泛素编码区 cDNA 序列的克隆及在原核细胞中的表达

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用。本研究根据 GenBank 已登录的真核生物泛素（ubiquitin）编码框的氨基酸序列,设计一对简并引物,RT-PCR 克隆了家蝇 Musca domestica 泛素基因的编码区 cDNA 序列,并进行了测序。序列分析表明,该编码区的长度为 228 bp,编码 76 个氨基酸,命名为 Mdubi ,GenBank 登录号为 DQ115796。同源性比较发现,Mdubi 氨基酸序列与其他真核生物泛素编码框同源性可达 94% 以上。RT-PCR 检测表明,Mdubi 在家蝇不同组织中均高效表达,且不受大肠杆菌 Escherichia coli 刺激的影响,是遍在性表达。为进一步研究 Mdubi 的结构和功能,将 Mdubi 克隆到原核表达载体 pQE30 上,构建重组质粒 pQE30-UBI,转化大肠杆菌 M15 感受态细胞,在 IPTG 诱导下进行了高效表达,SDS-PAGE 检测表明 Mdubi 在大肠杆菌中可表达相对分子质量为 9.6 kD 的可溶性融合蛋白;Western blot 分析表明表达产物能与 Ni-NTA 鏊合物特异性的结合,表明表达的 Mdubi 为 N 端带有 6His 标签的融合蛋白。利用 Ni²⁺-NTA 亲和柱一步纯化了 Mdubi,以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗 Mdubi 血清。本研究成功克隆了家蝇泛素的编码序列,并在原核细胞中得到了表达,为进一步研究泛素在家蝇体内的作用机制奠定了基础。     

人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达

为了利用基因工程生产胰岛素,按照已知的人胰岛素Ａ、Ｂ链氨基酸序列和大肠杆菌偏爱的氨基酸密码子设计并合成了人胰岛素原类似物（ＢＫＲＡ）基因,其中以赖（Ｋ）－精（Ｒ）二肽编码区取代人胰岛素原Ｃ肽编码区．为了避免其编码蛋白在大肠杆菌中表达时被降解,通过人工接头将２个ＢＫＲＡ基因串联起来,接头部分氨基酸序列为Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ．将串联的ＢＫＲＡ基因克隆到表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）,实现了在大肠杆菌中的融合表达,表达产物以包含体形式存在,约占细菌总蛋白２４％．表达产物氨基末端具有六组氨酸肽段,以ＨｉＴｒａｐ凝胶进行亲和层析,一步纯化可达纯度９５％以上．放射免疫测定表明,纯化的融合蛋白具有胰岛素抗原活性．表明已构建成人胰岛素原类似物的高效表达菌株     

大鼠胰岛素样生长因子Ⅰ基因的克隆及表达

以大鼠染色体DNA为模板,PCR分别扩增胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因外显子2编码区和外显子3编码区,并使外显子2编码区的3′端与外显子的3编码区的5′端有相同的40个碱基,采用外显子拼接法,以两种扩增产物为模板再次进行PCR,得到210bp的大鼠IGF-Ⅰ基因编码序列,将此序列克隆入pUC18质粒进一步构建表达型重组粒pGEX-IGF-Ⅰ,并在大肠杆菌DH5α中进行诱导表达。表达产物经SDS－PAGE分析及Western blot检测,并经体外实验证明其具有刺激细胞增殖的生物活性。     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过ＰＣＲ的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,ＤＮＡ全序列分析表明其结构基因全长１１５２个核苷酸（编码３８３个氨基酸）,５′端有一编码２６个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌ＩＰＴＧ诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的４０％以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的基因有正常的生物学功能。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化

拟南芥abi5基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类转录因子,它在ABA信号转导过程中发挥着关键调控作用。本文以拟南芥为材料,通过RT-PCR扩增、克隆了包含abi5基因编码区的片段。核苷酸序列分析表明,所克隆的基因与NCBI数据库收录的abi5基因（GenBank登录号NM129185.3）有99.0%的一致性;氨基酸序列存在4个残基差异。所克隆的abi5基因被进一步亚克隆至pET-32a表达载体。序列测定核实构建正确的重组质粒（pET32a-ABI5）转化入大肠杆菌BL21 Star（DE3）中诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果表明,重组abi5基因在大肠杆菌表达的较适宜条件为：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）终浓度为0.3 mmol L-1、30℃下诱导4 h,可达到细菌裂解液上清蛋白的29.1%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后的ABI5融合蛋白在SDS-PAGE电泳分析时呈现一条蛋白带。该条带经串联质谱分析证明为重组ABI5融合蛋白。     

家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

旨在对EST筛选得到的家蝇伴侣蛋白TCP-1(MD-TCPⅠ)基因进行序列分析,克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中诱导表达。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MD-TCPⅠ基因,对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增,以pET-28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果显示,MD-TCPⅠ基因ORF全长753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量27.07 kD;等电点5.92,该序列编码的蛋白属于热休克蛋白60家族的TCP。构建了正确基因序列MD-TCPⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。     

大肠杆菌脂蛋白与CTB-pres2抗原基因的融合及表达

首次采用基因融合方式,在乱毒素B亚基-乙型肝炎病毒Pres2抗原融合基因（ctxB-Pres2）的5’端了引入编码大肠杆菌脂蛋白信号肽及N端九个氨基酸的核苷酸序列,分别置于ctb及lpp／lac启动子下在大肠杆菌中获得分泌性表达．表达的融合蛋白均定位于膜上,并且可以和GM1、抗-CTB抗体及抗HBVPreS2单克隆抗体结合,说明该融合蛋白保留了CTB的基本高级结构及CTB、PreS2抗原的抗原性．3H-棕榈酸标记实验证实该融合蛋白发生脂肪化,为免疫原性研究奠定了基础．此外,还研究了不同信号肽和宿主菌对该蛋白表达的影响．     

小鼠Lin28基因的克隆及原核表达

目的探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法。方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点（NcoⅠ及XhoⅠ）引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上。对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a（+）载体相连接并转化Rosetta（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析。结果对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA（NM₁45833）相比同源性为99.37%,与参照氨基酸序列相比同源性为100%;在IPTG诱导下pET-30a（+）-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质。结论利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础。     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

头鲂胰岛素样生长因子-Ⅰ基因克隆与分析

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一单链多肽。在脊椎动物中，IGF-Ⅰ通过介导生长激素达到促进生长的作用。为研究鲤科鱼类IGF-Ⅰ的结构功能及在水产养殖中的潜在应用前景，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏的总RNA中扩增出IGF-ⅠCdna。测定了该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆 的Cdna序列编码包括信号肽和B、C、A、D、E 6个区域的161个氨基酸。E区域分析结果表明所克隆的团头鲂IGF-Ⅰ序列属于IGF-ⅠEa-2亚型。     

重组人血小板生成素在大肠杆菌中表达的研究

采用化学法全合成了编码人血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＴＰＯ）成熟肽Ｎ端１５３氨基酸的基因序列,构建基于该合成基因的表达质粒,结果以谷胱甘肽转硫酶－ＴＰＯ１５３（ＧＳＴ－ＴＰＯ１５３）融合蛋白的方式获得了占全菌蛋白４０％的高效表达．进一步采用ＰＣＲ方法分别对ＴＰＯ合成基因及ＴＰＯｃＤＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）序列进行定点突变,以降低这一区域的Ｇ－Ｃ含量．将突变序列分别插入到ｐＢＶ２２０表达载体中,重组质粒在转化大肠杆菌ＪＭ１０９后,均获得了表达,其中ＴＩＲ区突变后的合成基因表达产物约占全菌蛋白的１５％．为研究基因下游结构对表达的影响,在不改变氨基酸组成的基础上,构建了ＴＰＯ合成基因与ＴＰＯｃＤＮＡ的杂合序列表达质粒．研究结果表明翻译起始效率是影响ｒｈ－ＴＰＯ在大肠杆菌中表达的重要因素之一,同时基因下游序列的组成对表达水平也会产生影响．     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

原壳小球藻番茄红素ε环化酶基因的克隆和分析

摘要：【目的】番茄红素ε环化酶（lycopene epsilon cyclase）是叶黄素代谢途径中处于分支位点的关键酶。它催化线性的番茄红素选择性环化,形成胡萝卜素,再进一步合成叶黄素（lutein）。本研究的目标是克隆原壳小球藻（Chlorella protothecoides CS-41）LCYE基因的全长cDNA,通过该基因的生物学信息分析预测其表达产物的空间结构与功能位点,并验证该表达产物的生物学活性。【方法】采用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends）和RT-PCR技术克隆原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA序列。分别采用PredictProtein、Pfam HMMs和Swiss-Model等在线分析软件分析LCYE的基本生物学信息,预测蛋白质功能位点和空间结构。利用pET28-a(+)构建LCYE基因的原核表达质粒pET-LCYE,并转入大肠杆菌BL21（DE3）,再利用IPTG诱导LCYE基因超量表达。此外,携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌能够积累番茄红素,可用于验证LCYE基因编码蛋白的酶活。【结果】获得了原壳小球藻的LCYE基因的cDNA序列,长2107 bp,GenBank登录号为FJ752528。序列分析表明：它含有1731 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码576个氨基酸,与高等植物和其他藻类的LCYE有很高的相似性,其中相似性最高的是莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii XM001696477.1）,达到67%。第48～459个氨基酸残基为一个典型的番茄红素环化酶蛋白（Lycopene cyclase protein）结构域（pfam05834）,第261～284个氨基酸残基为一个典型的环化酶保守的模体。SDS-PAGE检测表明,LCYE基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了超量表达。携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌在获得LCYE基因后,其颜色从粉红色变为黄色。【结论】原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA为2107 bp,预测出番茄红素ε环化酶所特有的保守功能区域,构建了它的三维结构模型。同时,阐明了小球藻和衣藻的亲缘关系。最后,证实了本研究克隆到的LCYE基因编码的蛋白具有番茄红素ε环化酶的功能与活性。     

薇甘菊乙醇酸氧化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

利用SSH和RACE相结合的方法获得了薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长,并对该序列进行了生物信息学分析。随后将该基因的cDNA编码区克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒,转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行表达。序列分析表明,薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长1 363 bp,编码369个氨基酸,命名为MmGO（GenBank登录号EU716626）,推测的MmGO分子量为40.32 kDa,等电点为8.99。系统进化分析表明,MmGO与芸苔的GO序列亲缘关系比较近。将该基因重组到pET-32a(+)中进行原核表达,经0.1 mmol·L^-1 IPTG,25℃诱导4 h,获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His MmGO,Western-blot证实表达的6×His-MmGO能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为60 kDa,与预测的融合蛋白6×His-MmGO分子量相符。为进一步研究融合蛋白6×His-MmGO的活性和功能奠定了基础。     

烟实夜蛾触角化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术扩增了编码烟实夜蛾 Helicoverpa assulta 触角化学感受蛋白（chemosensory protein）的全长cDNA。克隆和测序结果表明,烟实夜蛾化学感受蛋白基因核苷酸序列全长384 bp(GenBank序列号： DQ285667),编码127个氨基酸残基,预测N-末端包含16个氨基酸组成的信号肽序列,因此估测其成熟蛋白分子量为12.97 kD,等电点为5.32。将该基因重组到表达载体pGEX-4T₂中,并转入原核细胞中进行表达。SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导后,烟实夜蛾化学感受蛋白基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条约39 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。     

普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析

基于NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因(ABE99707)的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以烟草栽培品种红花大金元叶片总RNA为模板,通过PCR方法获得了烟草NtPDS基因的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1749 bp,编码582个氨基酸,推测该蛋白等电点为7.53,理论分子量为65.04 kD。通过构建融合表达载体pET-32a-NtPDS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h表达后,产生了以可溶性蛋白形式存在的NtPDS融合蛋白,并通过Western blotting验证融合蛋白获得表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在烟草的叶片、花和茎中均有表达,在根中没有表达。该结果为进一步研究烟草八氢番茄红素脱氢酶NtPDS的活性和生物学功能奠定了基础。     

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。