家蝇泛素编码区 cDNA 序列的克隆及在原核细胞中的表达

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径，该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用。本研究根据 GenBank 已登录的真核生物泛素（ubiquitin）编码框的氨基酸序列，设计一对简并引物，RT-PCR 克隆了家蝇 Musca domestica 泛素基因的编码区 cDNA 序列，并进行了测序。序列分析表明，该编码区的长度为 228 bp，编码 76 个氨基酸，命名为 Mdubi ，GenBank 登录号为 DQ115796。同源性比较发现，Mdubi 氨基酸序列与其他真核生物泛素编码框同源性可达 94% 以上。RT-PCR 检测表明，Mdubi 在家蝇不同组织中均高效表达，且不受大肠杆菌 Escherichia coli 刺激的影响，是遍在性表达。为进一步研究 Mdubi 的结构和功能，将 Mdubi 克隆到原核表达载体 pQE30 上，构建重组质粒 pQE30-UBI，转化大肠杆菌 M15 感受态细胞，在 IPTG 诱导下进行了高效表达，SDS-PAGE 检测表明 Mdubi 在大肠杆菌中可表达相对分子质量为 9.6 kD 的可溶性融合蛋白；Western blot 分析表明表达产物能与 Ni-NTA 鏊合物特异性的结合，表明表达的 Mdubi 为 N 端带有 6His 标签的融合蛋白。利用 Ni²⁺-NTA 亲和柱一步纯化了 Mdubi，以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗 Mdubi 血清。本研究成功克隆了家蝇泛素的编码序列，并在原核细胞中得到了表达，为进一步研究泛素在家蝇体内的作用机制奠定了基础。

Cloning and prokaryotic expression of the cDNA sequence encoding ubiquitin from Musca domestica