西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

不同影响因素对热原实验中兔筛选的影响

目的分析不同影响因素对新西兰兔的初次筛选合格率、二次筛选合格率的影响。方法根据2005版《中国药典》进行测定。结果初次筛选结果中,不同季节、体重值、性别、湿度新西兰兔的筛选率都有显著性差异,筛选时间在7～9月、体重值为1.7～2.0 kg、雄性的新西兰兔、在湿度为61～70%的条件下初次筛选率较高;在二次筛选结果中,不同季节、室温、湿度条件下新西兰兔的筛选率都有显著性差异,筛选时间在1～3月、在室温为22.1～23.0℃、湿度为61～70%的条件下新西兰兔的二次筛选率较高。结论在不同影响因素的条件下,新西兰兔的初次筛选合格率、二次筛选合格率均受到影响。     

大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达

目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

家蚕鞣化激素基因对翅展及繁殖力的调控作用

【目的】昆虫鞣化激素(Bursicon)是由神经系统分泌的一种异源二聚体神经肽,对昆虫表皮鞣化、翅展等功能具有调控作用。本研究旨在探究鞣化激素基因与家蚕Bombyx mori翅发育及对繁殖力相关基因的关系,明确其对翅展和繁殖力的调控作用。【方法】采用RNAi技术,分别注射Bursicon基因的dsRNA(dsBmBurs-α, dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β)到家蚕1日龄蛹,以注射dsGFP为对照。观察RNAi后家蚕表型,并计算家蚕单雌产卵量;利用实时定量PCR技术检测Bursicon基因RNAi后家蚕羽化后24 h成虫中翅发育相关基因(BmWg, BmFt, BmFj和BmDs)和RNAi 48和72 h后家蚕蛹中繁殖相关基因(卵黄原蛋白基因BmVg和卵黄原蛋白受体基因BmVgR)的表达水平。【结果】家蚕Bursicon基因被RNAi后,羽化后24 h的家蚕翅不能正常伸展,dsBmBurs-α,dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β处理组的翅畸形率分别为93.33%, 96.67%和96.43%;平均单雌产卵量分别为312.67, 332.00和284.00粒,显著低于对照组(406.00粒)。RNAi干扰Bursicon基因后,家蚕Bursicon基因BmBurs-α和BmBurs-β表达量显著下调,其相关基因BmWg, BmFt, BmFj, BmDs, BmVg和BmVgR的表达水平均显著低于对照组。【结论】鞣化激素基因参与调节家蚕翅发育相关基因的转录水平来调控翅展。同时,它们还可以参与调节繁殖相关基因BmVg和BmVgR的表达,从而影响家蚕的繁殖。     

广州地区三种小型猪血液生理生化指标的比较

目的比较广州地区西藏小型猪、五指山小型猪和巴马小型猪血液生理生化指标的差异。方法全自动血液细胞和生化分析仪测定24个血液生理生化指标。结果 24个指标中,血红蛋白、白细胞、单核细胞、血细胞比容、葡萄糖指标的测定差异显著;淋巴细胞、中性粒细胞、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标的测定差异极显著。其中血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标以西藏小型猪最高,白细胞、淋巴细胞指标以五指山小型猪最高,而中性粒细胞、单核细胞、葡萄糖指标以巴马小型猪最高。结论三种小型猪血液生理生化指标的比较,为建立小型猪生物学特性数据库提供了理论依据。     

正交试验优化青防肿痛外敷散纯化工艺

目的:优选青防肿痛外敷散最佳纯化工艺。方法:以干膏率、青藤碱及粉防己碱转移率为指标,设置综合评分。单因素考察筛选直接沉淀法和水沉淀法,正交试验法优选水沉淀法中最佳相对密度、放置时间和加水倍量,将水沉淀法和直接沉淀法及纯化前试验数据对比,并将最佳纯化工艺做三批重复性验证试验。结果:水沉淀法最佳工艺为将滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(70℃)的稠膏,稠膏加7倍量的水搅匀,放置48 h。单因素试验结果证明水沉淀法优于直接沉淀法。重复性试验验证结果证明工艺稳定可靠。结论:此纯化工艺可在保留活性成分的同时,有效的去除杂质,最大程度减少使用剂量,为后期制剂成型和中试放大生产研究奠定了良好基础。