利用假型反转录病毒对大部分胰腺切除后再生细胞的世系追踪

胰腺是一个重要的内外分泌混合腺, 胰腺发生损伤后能够再生。为了探讨胰腺活体细胞世系追踪的方法和胰腺损伤后再生细胞的来源,分别通过胰腺伤口涂抹并胰内注射、尾静脉注射及腹腔注射三种方法, 利用假型反转录病毒对成体小鼠大部分切除后胰腺的细胞进行世系追踪。结果发现在活体条件下, 与尾静脉注射及腹腔注射法相比, 胰腺伤口涂抹并胰腺内注射反转录病毒的方法能够更有效的标记胰腺细胞; 而且, 通过对标记细胞的世系追踪研究证明, 在胰腺损伤后, 胰腺腺泡细胞能够接受损伤信号刺激发生再生。为今后进一步利用反转录假病毒对活体胰腺进行细胞命运追踪研究奠定基础, 为利用反转录病毒载体进行胰腺疾病的基因治疗提供线索。     

室温下保存的小鼠屠体卵巢GV卵的发育能力

将ICR系雌性小鼠处死并在10℃、15℃、20℃和25℃下依次保存8、14、24和48 h后,采集其体内的卵巢GV期卵,采用常规方法进行体外成熟和体外受精,获得的2细胞期胚经体外培养或胚胎移植观察其发育能力.其结果,在10℃下保存24 h、15℃下保存14 h、20℃下保存8h和25℃下保存4 h后,其体内附有卵丘细胞的GV卵的体外成熟-体外受精后的2细胞率分别为14%、9%、10%和10%,随着保存温度的提高和保存时间的延长,带有颗粒细胞GV期卵的比率明显降低,同时其GV期卵经体外成熟及体外受精后的2细胞率明显降低.在20℃下保存24 h和25℃下保存14 h时,难以获得形态正常的GV期卵;体外受精获得的2细胞期胚经体外培养,总体上有64%的胚胎发育至扩张囊胚,未见有保存温度和保存时间的显著影响,且利用在15℃保存8 h后的GV卵获得2细胞期胚的移植获得正常新生小鼠.上述结果表明,雌性动物室温条件下死亡后,若能短时间及时采集其体内GV期卵并体外成熟、体外受精,体外培养及胚胎移植技术,就有可能获得新生后代.     

小鼠胰腺大部分切除后再生集中区来源的初步探索

目的:探讨胰腺在某些损伤或病理条件下,由于细胞活跃增殖产生再生集中区域的细胞来源。方法:将27只成年ICR系小鼠分为9组,每组3只,其中1组进行假手术,其余8组进行小鼠胰腺大部分切除,分别在切除后12h,24h、36h、48h、3d、5d、7d、10d取材及冰冻切片,采用H-E染色、免疫荧光染色方法检测损伤后各时间段胰腺组织的形态变化和细胞增殖率。结果:H-E染色发现,胰腺手术72h后,剩余胰腺中就出现由细胞角蛋白阳性导管样结构组成的再生集中区,此区域细胞随后分化为功能性细胞类型,10d后消失检测不到。对胰腺再生集中区的定位研究表明,它们仅出现于切除后的伤口边缘。BrdU标记表明,胰腺再生集中区为细胞快速增殖区域,其出现与总导管增殖率提高同时发生,主/大导管和小导管增殖率上升都晚于再生集中区的出现。结论:小鼠胰腺大部分切除后再生集中区可能来源于腺泡细胞的快速增殖,而不是经由总-主/大-小导管-快速增殖区这一途径引起的来源于导管上皮细胞。     

ICR系雄性小鼠月龄对体外受精的影响

目前 ,小鼠体外受精技术越来越完善 ,已被广泛应用于其他生物工程技术领域。以往在体外受精时 ,通常使用性成熟的小鼠。而有关适合体外受精的雄性小鼠的月龄期限的研究尚未见有报道。为了确定适合小鼠体外受精的雄性小鼠的月龄期限 ,本研究探讨了雄性小鼠的月龄对体外受精的影响。1　材料与方法1 1　实验小鼠　选择 2～ 14月龄的ＩＣＲ系雄性小鼠和性成熟ＩＣＲ系雌性小鼠 (5～ 8周龄 )。1.2　体外受精　采用颈椎脱椎法宰杀实验用雄性小鼠后 ,采取附睾尾精子 ,用经二氧化碳培养箱 (37℃ ,5 %ＣＯ2 ,95 %空气 ,加湿 )中预平衡 12ｈ以上的 16…     

利用假型反转录病毒对大部分胰腺切除后再生细胞的世系追踪

胰腺是一个重要的内外分泌混合腺, 胰腺发生损伤后能够再生。为了探讨胰腺活体细胞世系追踪的方法和胰腺损伤后再生细胞的来源,分别通过胰腺伤口涂抹并胰内注射、尾静脉注射及腹腔注射三种方法, 利用假型反转录病毒对成体小鼠大部分切除后胰腺的细胞进行世系追踪。结果发现在活体条件下, 与尾静脉注射及腹腔注射法相比, 胰腺伤口涂抹并胰腺内注射反转录病毒的方法能够更有效的标记胰腺细胞; 而且, 通过对标记细胞的世系追踪研究证明, 在胰腺损伤后, 胰腺腺泡细胞能够接受损伤信号刺激发生再生。为今后进一步利用反转录假病毒对活体胰腺进行细胞命运追踪研究奠定基础, 为利用反转录病毒载体进行胰腺疾病的基因治疗提供线索。     

PMSG、E_2、PGF_(2α)和hCG组合处理对初情前蓝狐卵巢和子宫的影响

为了完善提高狐狸繁殖效率的超排技术,探讨了用PMSG、E2、PGF2α和hCG的不同组合处理对诱发初情前雌性蓝狐发情及其对卵巢和子宫发育的影响.EPP组(E2、PMSG和PGF2α组合)和EPPh组(E2、PMSG、PGF2α和hCG组合)分别有2只和3只发情,而对照组未见发情;EPP和EPPh组卵巢指数和有腔卵泡百分率显著高于对照组(P<0.05),而初级卵泡所占百分率则显著低于对照组.此外,EPPh组次级卵泡所占百分率与对照组相比显著降低(P<0.05);当用EPP和EPPh法处理雌性蓝狐后,子宫指数、子宫壁和子宫内膜厚度显著高于对照组(P<0.05).结果 表明,EPP和EPPh处理不仅具有诱发雌性蓝狐发情的功效,而且能够提高初情前雌性蓝狐卵巢指数和增加有腔卵泡数量.     

小鼠胰腺大部分切除后再生集中区来源的初步探索

目的：探讨胰腺在某些损伤或病理条件下,由于细胞活跃增殖产生再生集中区域的细胞来源。方法：将27只成年ICR系小鼠分为9组,每组3只,其中1组进行假手术,其余8组进行小鼠胰腺大部分切除,分别在切除后12h,24h、36h、48h、3d、5d、7d、10d取材及冰冻切片,采用H-E染色、免疫荧光染色方法检测损伤后各时间段胰腺组织的形态变化和细胞增殖率。结果：H-E染色发现,胰腺手术72h后,剩余胰腺中就出现由细胞角蛋白阳性导管样结构组成的再生集中区,此区域细胞随后分化为功能性细胞类型,10d后消失检测不到。对胰腺再生集中区的定位研究表明,它们仅出现于切除后的伤口边缘。BrdU标记表明,胰腺再生集中区为细胞快速增殖区域,其出现与总导管增殖率提高同时发生,主/大导管和小导管增殖率上升都晚于再生集中区的出现。结论：小鼠胰腺大部分切除后再生集中区可能来源于腺泡细胞的快速增殖,而不是经由总-主/大-小导管-快速增殖区这一途径引起的来源于导管上皮细胞。     

利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎

目的通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础。     

microRNA在诱导体细胞重编程中的作用

microRNA是调控基因转录后水平的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。大量研究证实, microRNAs广泛分布于真核生物, 其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell, iPS)是将体细胞诱导成为具有胚胎干细胞性质的多潜能干细胞。iPS过程的核心为体细胞表观遗传状态发生重编程, 因此, 探明体细胞重编程机制对建立完善的iPS技术具有重要理论和实际意义。利用病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等因子导入体细胞的方法已不断发展, 但“基因组整合”及原癌基因的参与增加了诱导细胞的致癌率。随着使用腺病毒、质粒或蛋白诱导等“非整合型”方法及L-myc的替换均可获得具有多潜能性的干细胞, 癌变的风险大大降低。但其发生的理论机制仍不十分清楚。最近的研究证实, microRNAs影响体细胞的重编程过程, 特别是miR302/367、miR200、miR-34和miR290/295等家族的microRNAs在体细胞诱导为iPS过程中发挥重要作用。文章就近年microRNA在诱导多能干细胞中的作用进行综述。     

哺乳动物DNA甲基化及其在体细胞诱导重编程中的作用

诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell, iPS)技术提供了将终末分化的细胞逆转为多潜能干细胞的可能, 在干细胞基础理论研究和再生医学中具有重要意义。然而, 目前体细胞诱导重编程方法效率极低, 常发生不完全的重编程。研究表明, 在不完全重编程的细胞中存在体细胞的表观遗传记忆, 而DNA甲基化作为相对长期和稳定的表观遗传修饰, 是影响重编程效率和iPS细胞分化能力的重要因素之一。哺乳动物DNA甲基化是指胞嘧啶第五位碳原子上的甲基化修饰, 常发生于CpG位点。DNA甲基化能够调节体细胞特异基因和多能性基因的表达, 因此其在哺乳动物基因调控、胚胎发育和细胞重编程过程中发挥着重要作用。此外, 异常DNA甲基化可能导致iPS细胞基因印记的异常和X染色体的失活。文章重点围绕DNA甲基化的机制、分布特点、及其在体细胞诱导重编程中的作用进行了综述。