斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅡcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

采用同源克隆结合RACE的方法克隆了斜纹夜蛾的普通气味结合蛋白Ⅱ（S1GOBPⅡ）的cDNA序列（GenBank登录号为EU086371）。序列分析表明，S1GOBPⅡ可读框序列为489bp，编码162个氨基酸，分子量为18.2kD，等电点为5.72。S1GOBPⅡ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基，呈酸性。S1GOBPⅡ氨基酸序列与草地贪夜蛾（S.frugiperda）和甜菜夜蛾（S.exigua）气味结合蛋白具有较高的同源性。RT-PCR和Northem blot检测表明，SIGOBPⅡ具有触角组织表达特异性。将S1GOBPⅡ，克隆到表达载体pET-32a上，阳性重组子转化表达宿主菌BL21（DE3）中，在IPTG诱导下进行了高效表达。SDS-PAGE检测表明S1GOBPⅡ在大肠杆菌中可表达相对分子质量（Mr）为32.0kD的可溶性融合蛋白，Westem blot分析表明表达产物能与Ni-NTA螯合物特异性结合，表明表达的S1GOBPⅡ为N端带有6His标签的融合蛋白。利用Ni^2＋-NTA亲和柱进一步纯化了S1GOBPⅡ，以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗S1GOBPⅡ的抗血清，ELISA滴度为1：12800，Western印迹检测结果显示，S1GOBPⅡ抗血清与表达的融合蛋白呈阳性反应，表明所表达的融合蛋白仍保持原有蛋白的免疫原性。     

苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)表达及其生长发育的影响

【目的】几丁质酶和几丁质合成酶对昆虫的变态发育极其重要。本研究旨在阐明苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾Spodoptera litura几丁质酶和几丁质合成酶基因表达及其生长发育的影响。【方法】利用RT-qPCR检测斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)在斜纹夜蛾不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和4-6龄幼虫不同组织(体壁、中肠、脂肪体、血细胞、头部和马氏管)中的表达水平以及注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/头) 24, 48和72 h时斜纹夜蛾SlCht和SlCHS-A在6龄幼虫各组织中的表达水平。分析在斜纹夜蛾4龄幼虫中注射不同浓度(31.25, 62.5, 125, 250和500 ng/头)的苦瓜素Ⅰ溶液对幼虫和蛹历期、幼虫增重、蛹重、蛹长度、化蛹率、羽化率和存活率的影响,并利用体视显微镜观察斜纹夜蛾幼虫的表型变化。【结果】SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾中的表达具有发育阶段特异性。SlCht和SlCHS-A在卵期表达量最高,幼虫期和预蛹期的表达量较低;在各幼虫期又表现为6龄幼虫期表达量最高,在其他龄期的表达量低。SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾6龄幼虫中也显示出组织特异性表达,在血细胞和体壁中高表达,在头部、中肠和脂肪体中低表达。在斜纹夜蛾6龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ能诱导SlCht和SlCHS-A在其各组织中表达量降低;在4龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ后,斜纹夜蛾的生长发育受到抑制,幼虫增重延缓,发育历期延长,化蛹率下降甚至化蛹失败,幼虫及蛹出现较高的畸形率。【结论】苦瓜素Ⅰ可通过诱导SlCht和SlCHS-A表达量的降低来实现对斜纹夜蛾生长发育的抑制作用。本研究为进一步阐明苦瓜素对斜纹夜蛾生长发育的抑制机制提供了新的理论基础,并为进一步应用苦瓜素Ⅰ进行防控奠定了基础。     

小菜蛾肠道成团泛菌PxG45的分离鉴定及其抗真菌活性

【目的】昆虫肠道共生细菌是栖息在昆虫肠道中的微生物,是肠道微生物群落中最主要的成员。它们对昆虫的生长发育、营养吸收以及免疫系统均具有重要影响。本研究通过对小菜蛾Plutella xylostella肠道共生细菌进行分离培养和功能鉴定,以探究肠道共生细菌对小菜蛾适应性的影响及其对真菌的广谱抑制作用。【方法】利用体外平板培养分离纯化小菜蛾3龄幼虫肠道细菌PxG45菌株,结合形态学、16S rDNA基因测序和生理生化测定进行菌种鉴定。利用生物测定探究PxG45对小菜蛾3龄幼虫存活率及球孢白僵菌Beauveria bassiana侵染小菜蛾3龄幼虫对存活率的影响。通过平板对峙法检测PxG45对球孢白僵菌的抑制作用,进一步检测PxG45对植物病原真菌希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum、刺盘孢炭疽菌C.camelliae、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusarium oxysporum f. sp.cubense race 4、茄链格孢菌Alternaria solani、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和丁香假单胞菌杨梅致病变种Pseudomona...     

斜纹夜蛾抗菌肽基因Moricin和Cecropin时空表达模式及微生物敏感性的分析

抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽, 包括抗细菌、 病毒和真菌。本研究以斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius)为研究对象, 利用Real-time PCR和半定量RT-PCR检测了其体内两个重要抗菌肽基因Cecropin和Moricin的时空表达模式及其对微生物的敏感性。Real-time PCR检测结果表明, 抗菌肽基因Cecropin和Moricin在斜纹夜蛾各个龄期（1, 2, 3, 4, 5和6龄幼虫、 蛹、 成虫）都有表达, 随着龄期的增长, 表达量逐渐增加, 6龄幼虫中表达量达到最高。 半定量RT-PCR检测表明, 抗菌肽基因Cecropin和Moricin在7个不同组织（气管、 卵巢、 马氏管、 体壁、 中肠、 脂肪体和血细胞）中都有表达, Cecropin在脂肪体中表达量最高, 而Moricin在血细胞中表达量相对较高; RT-PCR检测表明, Cecropin和Moricin的表达在大肠杆菌Escherichia coli诱导后迅速上升, 其中诱导后8 h达到高峰期, 一直持续到48 h。不同病原微生物（大肠杆菌E. coli、 金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus和白僵菌Beauveria bassiana）分别诱导后, Real-time PCR 检测表明, 斜纹夜蛾抗菌肽基因Cecropin和Moricin对大肠杆菌的刺激最为敏感。本研究结果为进一步研究斜纹夜蛾抗菌肽基因Cecropin和Moricin的功能奠定基础。     

小菜蛾整合素integrin β1基因的克隆及其功能分析

整合素(Integrin)是一种由α和β亚基组成的跨膜异二聚体蛋白,在昆虫血细胞对外物的包囊过程中起着重要的作用。为阐明integrinβ1参与小菜蛾Plutella xylostella体内细胞免疫中的功能,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆了小菜蛾integrinβ1基因的cDNA全长序列,命名为PxIntβ1(Gen Bank登录号GQ178290)。小菜蛾PxIntβ1的cDNA全长序列为2 832 bp,开放阅读框为2 487 bp,编码828个氨基酸,成熟的氨基酸序列中有一个跨膜区和一个integrin亚基。系统进化树显示小菜蛾PxIntβ1与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis整合素的同源性最高,两者同源性达到78%。利用半定量RT-PCR技术检测PxIntβ1基因在小菜蛾不同发育历期(卵、1-4龄幼虫、蛹、成虫)、不同组织(血细胞、体壁、脂肪体、中肠、马氏管)和细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液)诱导下的表达模式。半定量结果表明小菜蛾PxIntβ1基因在小菜蛾整个发育历期除了卵之外都有表达,4龄幼虫转录水平最高,在血细胞中特异性的高表达,混合细菌诱导2-48 h后,PxIntβ1基因在小菜蛾诱导后24 h达到诱导表达高峰。为了进一步获得重组蛋白PxIntβ1,本研究构建了原核表达质粒pET-32a-PxIntβ1,融合蛋白在大肠杆菌Eschericha coli BL21中获得高效表达,Ni-NTA一步纯化了融合蛋白,并免疫新西兰大白兔,获得了多克隆抗体anti-PxIntβ1。SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果表明,His抗体和多克隆抗体anti-PxIntβ1能特异性识别融合蛋白PxIntβ1;进一步利用显微镜观察了小菜蛾血细胞对凝胶珠Sephadex-A25的包囊情况,结果表明抗血清anti-PxIntβ1处理过的小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用受到明显抑制,重组蛋白PxIntβ1可以提高小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用;以上研究结果表明小菜蛾PxIntβ1在小菜蛾细胞免疫中起着重要的作用。     

红火蚁Toll受体家族免疫响应绿僵菌表达模式的研究

为探究红火蚁Solenopsis invicta Buren Toll受体家族基因如何免疫响应绿僵菌Metarhizium的侵染。本研究采用浸渍法测定了不同浓度下绿僵菌对红火蚁大中小3种不同大小工蚁的致病力,并用显微镜观察了绿僵菌侵染后红火蚁3种工蚁的表型变化。利用生物信息学筛选Toll受体基因,并对Toll受体家族基因的理化性质、结构域、染色体位置、系统进化进行分析鉴定。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了红火蚁大中小型工蚁中Toll受体家族的发育历期和绿僵菌侵染后的表达模式。结果表明,绿僵菌在96 h对红火蚁大中小型工蚁的致死中浓度（LC50）分别为5.8×10^7孢子/mL、3.1×10^7孢子/mL、1.5×10^7孢子/mL;绿僵菌侵染红火蚁第3天,显微镜下观察到红火蚁体壁细小的菌丝,虫体僵硬,寄主死亡后菌丝迅速蔓延并逐渐长成橄榄绿色分生孢子;RT-qPCR结果表明Toll受体基因在红火蚁不同发育阶段中的mRNA表达水平存在显著差异,且Toll受体基因在雌性生殖蚁表达水平显著高于雄性生殖蚁;RT-qPCR结果表明红火蚁大中小型工蚁Toll受体免疫响应绿僵菌不一样。在大型工蚁中,绿僵菌侵染后,Toll受体家族基因能显著上调表达,6 h是一个诱导高峰期,Toll2-1和LRR转录水平最高,响应绿僵菌最强;在中型工蚁中,绿僵菌不能刺激Toll2-2基因的表达,却能强烈诱导Toll1,Toll2-1,Toll6,Toll7和LRR基因的上调表达,Toll1和Toll2-1响应绿僵菌最强。在小型工蚁中,绿僵菌能显著诱导Toll受体家族基因基因的上调表达,在24 h时,LRR基因表达量最高,相比于对照,LRR基因表达提高25倍,LRR在6 h和24 h响应绿僵菌最强。以上研究表明Toll受体可以免疫响应入侵的绿僵菌,且不同的Toll对绿僵菌可能具有不同的响应机制。本研究为进一步阐明Toll受体的功能奠定基础,为进一步利用绿僵菌控制红火蚁提供技术指导。     

小菜蛾PGRP-SA的体外表达及介导酚氧化酶活力的研究

肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins,PGRPs)是可以识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌的一类模式识别受体,在介导酚氧化酶级联反应中起着重要的作用。本研究以实验室克隆的小菜蛾Px PGRP-SA(Gen Bank No.EU399240)为基础,RT-PCR克隆了其开放阅读框(ORF),在原核细胞中获得了高效重组表达,利用GST一步纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备了抗血清,滴定效价为1∶51200。Western blot检测表明Micrococcus luteus和Serratia marcescens可以显著提高Px PGRP-SA在小菜蛾血淋巴中的含量。为了检测Px PGRP-SA与酚氧化酶PO的活力关系,本研究将Px PGRP-SA连接到真核表达载体p MT/Bip/V5/His A构建真核表达质粒p MTAPGRP,转染果蝇S2细胞中,获得稳定的细胞系,硫酸铜诱导获得表达后用anti-V5纯化获得重组蛋白Px PGRP-SA。将重组蛋白Px PGRP-SA与M.luteus和S.marcescens分别温育后,可以显著提高小菜蛾血浆中PO的活力。本研究结果阐明了重组蛋白Px PGRP-SA在小菜蛾体PO级联反应中的功能,为进一步研究Px PGRP-SA在小菜蛾体内免疫信号通路中的功能奠定了基础。     

红火蚁Serpin家族基因鉴定及其在绿僵菌侵染下的表达模式分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor, Serpin）在昆虫Toll通路和PPO级联反应的防御机制中起着至关重要的作用。本研究利用现代生物信息学工具预测和分析了红火蚁Solenopsis invicta中Serpin家族的结构和功能多样性。染色体定位表明,红火蚁基因组中7个Serpin基因家族成员不均匀的分布在4条染色体上。结构域分析表明,SiSerpin蛋白具有Serpin基因的保守结构,即典型的反应中心环（Reactive central loop, RCL）结构与Serpin结构域,不同成员蛋白拥有多样化的基序。系统进化分析表明,红火蚁Serpin蛋白与其他的昆虫Serpin蛋白有较高亲缘关系,SiSerpin7与烟草天蛾Manduca sexta的Serpin3a亲缘关系最近,SiSerpin12与黄粉虫Tenebrio molitor Serpin55亲缘关系最近,SiSerpin13与烟草天蛾Serpin6亲缘关系最近,SiSerpin4与家蚕Serpin27亲缘关系最近。为了进一步明确红火蚁Serpin家族在绿僵菌Metarhizium侵染后的表达模式,用绿僵菌侵染不同体型的工蚁,荧光定量PCR（RT-qPCR）分析表明,红火蚁Serpin基因家族成员能在早期响应绿僵菌的侵染;除SiSerpin7基因外,大型和小型两种工蚁的表达模式存在较大的差异。结果表明红火蚁Serpin家族作为免疫调控蛋白,能够响应绿僵菌的侵染,且在红火蚁不同体型工蚁之间存在着不同的免疫调控模式。这些发现不仅为Serpins的功能分析提供了理论基础,而且有可能有助于绿僵菌作为一种有效的生防剂的开发。     

案例教学法在《植物检疫学》教学的实践与探索

根据植物检疫学课程特点,探讨了在教学中开展案例教学法的必要性,并以检疫性害虫红火蚁为例,说明案例教学在植物检疫学课程中的应用。案例教学法改变了课堂气氛,提高了学生的学习积极性、主动性和创造性,适合在教学实践中推广应用。     

死亡素与泛素在大肠杆菌中的高效融合表达

死亡素是由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽。为了高效表达可溶性的死亡素,本研究利用递归式PCR（recursive PCR, rPCR）扩增了死亡素基因thanatin,并将其和家蝇Musca domestica泛素基因ubiquitin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,再与硫氧还蛋白融合后构建表达载体pET-TRX-UBI-THA。将酶切和测序鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21,经0.6 mmol/L IPTG诱导,TRX-UBI-THA融合蛋白得到了高效可溶性表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明融合蛋白的分子量为28.9 kD,与预期的结果一致,表达量占菌体总蛋白的46％。Western blot分析结果显示融合蛋白能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在融合蛋白的N-端带有6×His标签。利用C-端带有6×His标签的泛素C-端水解酶对融合蛋白进行切割,切割产物经Ni²⁺-NTA亲和柱和HPLC纯化（纯化量为5.4 mg/L）,Tricince-SDS-PAGE电泳得到单一的泛素蛋白条带。电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的泛素分子量为2.57 kD,与通过氨基酸预测的分子量完全一致。利用琼脂孔穴扩散法对泛素活性进行检测,结果显示纯化的泛素对大肠杆菌K12D31和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有较强的活性抑制。本研究表明,利用泛素融合技术可以高效表达可溶性的死亡素。