共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建

为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA。将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA。提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功。间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA。应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。     

人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。     

丙型肝炎病毒RNA多聚酶在昆虫细胞中的表达

HCV NS5B基因片段克隆入BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFASTHTc载体质粒,转化DH10BACTM感受态细菌获得重组的Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白.免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为HCV NS5B蛋白,具有多聚酶活性.     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性。正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性;表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100%。本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒N基因的杆状病毒表达及鉴定

利用分子克隆的方法,将CVS-11株狂犬病毒N基因片段克隆入杆状病毒穿梭载体Bacmid中,构建出含CVS-11 NP基因重组杆状病毒表达质粒Bacmid-N;脂质体介导Bacmid-N转染Sf9昆虫细胞获得表达CVS-11 NP的重组杆状病毒(AcMNPV-N)。用ELISA、FA、SDS-PAGE和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析,证实CVS-11 NP为胞内表达,且具有天然核蛋白良好的免疫反应性,为进一步研制高效、敏感的狂犬病病毒检测试剂和建立实验室检测方法奠定基础。     

鸡γ-干扰素在杆状病毒系统中的表达

目的：获得具有生物学活性的重组鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）。方法：应用RT-PCR方法扩增ChIFN-γ基因cDNA,将其克隆入杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1,构建重组质粒pFast-ChIFN-γ,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组质粒pBac-ChIFN-γ并转染昆虫细胞Sf9,采用间接免疫荧光试验（IFA）、ELISA试验鉴定重组ChIFN-γ的表达,通过细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性。结果：IFA、ELISA与细胞病变抑制试验结果显示,重组ChIFN-γ在杆状病毒系统中获得表达,其抗病毒活性达5×103～1×104U/mL。结论：重组ChIFN-γ的获得为其开发应用提供了重要的生物材料。     

BJ46a基因在昆虫细胞的转染、蛋白表达及超微结构观察

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a在杆状病毒表达系统的表达及宿主细胞Sf9超微结构的变化。方法将构建的杆状病毒重组穿梭载体Bacmid BJ46a,经Cellfectin脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,获重组杆状病毒颗粒;以高滴度病毒感染Sf9昆虫细胞,行Western blot观察BJ46a融合蛋白的表达。在病毒扩增、蛋白表达过程应用透射电镜和超薄切片技术观察Sf9细胞超微结构的变化。结果Western blot分析表明：在转染病毒的Sf9细胞出现BJ46a融合蛋白表达条带。电镜观察表明：Sf9细胞在病毒扩增过程,细胞核增大,病毒发生基质形成,杆状病毒在其周围装配。蛋白表达期间,杆状病毒量剧增,细胞核内外存在大量丝状纤维。结论BJ46a基因可在杆状病毒表达系统成功表达,并伴随着宿主细胞超微结构的显著变化,其结果为杆状病毒表达系统的研究奠定坚实的基础。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

基于CDR2和CDR3区随机突变筛选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的研究

基于抗原-抗体特异性反应的免疫学方法是黄曲霉毒素B1的常用检测方法。为制备针对AFB1的抗体,综合参考已报道的噬菌体文库筛选的抗AFB1单域重链抗体（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH）序列,合成一条经密码子优化[适于大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）表达]的高同源性序列。在抗AFB1 VHH的CDR2和CDR3区引入部分随机突变,构建噬菌体抗体库。采用phage-ELISA技术,以AFB1O-OVA为包被抗原,淘选单域重链抗体库,经过4轮筛选,获得15株能与AFB1特异性结合的阳性克隆。以结合力最高的1株克隆为材料,扩增相应的VHH基因,构建表达质粒pET-22b-VHH。在E. coli BL21（DE3）中表达VHH,经间接竞争ELISA分析,获得的抗AFB1 VHH的灵敏度约为10μg/mL。     

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因,连接至噬菌粒pCANTAB 5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coli HB2151,IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv,为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因,克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中,构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２,转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒ＤＮＡ,获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本,初步研究ＨＧＶＥ２糖蛋白的抗原性     

抗TNF-α单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定

应用噬菌体展示技术构建抗肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor α,TNF-α)单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,从中筛选抗TNF-αscFv并进行鉴定.利用重组人TNF-α(rhTNF-α)免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸反应将VH和VL基因拼接成scFv基因,以SfiⅠ/NotⅠ位点定向插入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1,构建了库容为4.6×108的抗TNF-α单链抗体库.对抗体库进行3轮富集筛选后,ELISA检测阳性克隆的抗原特异性,取1株阳性克隆进行测序分析.结果表明,抗TNF-αscFv基因序列长774bp,编码258个氨基酸.将此阳性克隆转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,scFv的分子量约为28kD.经亲和纯化后的scFv可与rhTNF-α结合,并可中和由rhTNF-α引起的L929细胞毒性.本文利用噬菌体抗体库筛选到了高亲和力的抗TNF-αscFv,为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础.     

密码子优化型HPV16L1基因在两种昆虫细胞中的表达

目的:提高16型人乳头瘤病毒（HPV16）L1基因在杆状病毒昆虫细胞中的表达水平,为研制预防性HPV疫苗奠定基础。方法:根据昆虫细胞密码子偏性对野生型HPV16L1基因进行改造,利用Bac-to-Bac表达系统获得重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9和High Five。Western blot鉴定表达产物;电镜下观察病毒样颗粒形成。利用ELISA法评价HPV16L1基因的优化效果,探讨L1蛋白表达的最佳条件。结果:在相对分子质量56kDa处出现HPV16L1的特异性条带;电镜下可见病毒样颗粒在昆虫细胞的核内形成;优化型HPV16L1基因的表达水平显著高于野生型。High Five细胞表达的最佳条件为MOI=10,表达时相72h,其L1蛋白表达量至少比Sf9细胞高3倍。结论:密码子优化技术确实能够促进HPV16L1蛋白的高效表达,而High Five细胞表现出的显著优势尤其值得关注。     

牛γ 干扰素的表达及其抗病毒活性测定

通过RT-PCR从经ConA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛γ干扰素 (BoIFN-γ) cDNA,克隆到真核载体pVAX1中,测序结果显示pVAX1中的插入序列BoIFN-γ基因与已报道序列一致。用重组质粒pVAX1-BoIFN-γ转染COS-7细胞并进行间接免疫荧光试验鉴定,结果显示BoIFN-γ在COS-7细胞中得到成功表达。将BoIFN-γ基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)、pGEX-6p-1后,分别转化重组表达菌BL21(DE3)、BL21后,通过对表达条件的优化,SDS-P