一种经miniSOG标记的人腺病毒的制备

为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。     

人腺病毒41型(HAdV-41)在293TE细胞中的形态发生研究

为研究人腺病毒41型(Human adenovirus type 41,HAdV-41)的形态发生过程,将其接种于293TE细胞,收获细胞制作超薄切片并染色,通过透射电子显微镜进行观察。结果显示HAdV-41可以通过非网格蛋白陷窝、网格蛋白陷窝及直接穿入的方式进入细胞;细胞微绒毛可参与HAdV-41进入细胞的过程;进入细胞的HAdV-41包裹于囊泡内、溶酶体内或游离于细胞浆内;HAdV-41最终以游离状态靠近细胞核核孔,并释放核糖核蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)进入细胞核;子代HAdV-41最先出现在细胞核内;在HAdV-41复制过程中出现纤维丝状包涵体、致密包涵体及条索状致密包涵体,包涵体结构与HAdV-41的形态发生过程有关;最终,HAdV-41以裂解细胞方式释放。本研究揭示了HAdV-41形态发生的部分过程,进一步丰富了HAdV-41的生物学信息。     

利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆

为了构建人5型腺病毒(HAdV-5)的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架(包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI),在引物的5'端添加HAdV-5基因组末端序列(约30NT)和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用PacⅠ酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路。     

原核表达人41型腺病毒(Ad41) 蛋白 V及其抗血清的制备

摘要：目的 人肠腺病毒Ad41被称为难养腺病毒,其难以培养的特性可能与次要核心蛋白V（Ad41 protein V,pV）表达不充分有关。本研究拟表达纯化Ad41 pV抗原,免疫动物制备抗血清,为研究Ad41难养性机理打下基础。方法 以野生型Ad41基因组DNA为模板,PCR扩增pV,克隆到原核表达载体pET30a(+),测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达,固化金属亲和层析(IMAC)方法纯化,免疫BALB/c小鼠制备抗血清,将获得的抗血清用于Western blot检测Ad41感染各细胞系后pV的表达。结果 克隆得到包括完全编码区的pV基因,表达质粒转化BL21(DE3)菌株,使用1 m mol/L IPTG 37℃诱导4 h,pV以包涵体形式表达,或使用0.5 m mol/L IPTG 25℃诱导8 h获得可溶性表达。利用皮下多点注射包涵体的方法免疫小鼠,得到抗pV抗血清;使用纯化的可溶性pV作为抗原对抗血清进行了鉴定,表明该抗血清可用于Western blot检测。等量野生型Ad41感染293或293E12细胞（一株稳定表达Ad41 E1B55K基因的293细胞）后,pV在293E12细胞的表达明显高于293细胞。结论 成功克隆了Ad41 pV基因,表达纯化了重组蛋白,获得了可用于Western blot检测的抗血清,为进一步研究Ad41难养性机理打下了基础。     

Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造

重组腺病毒是常用的基因转移载体,本文介绍一种对腺病毒基因组进行反向遗传改造的策略。拟在维持基因编码蛋白氨基酸序列不变的前提下,突变去除重组人5型腺病毒Ad5GFP基因组的PmeI酶切位点。软件分析腺病毒质粒pAd5GFP序列,选择限制性内切酶BamHI将pAd5GFP切割为大小11.7和24.6kb两个片段,24.6kb大片段自身环化形成一个质粒pAd5GB,PmeI位于其上。PmeI/AscI双酶切pAd5GB质粒,产生2.4kb和22.2kb两个片段;在引物部位引入突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaaT),PCR扩增得到两端各延长30bp的上述2.4kb片段,与22.2kb片段进行Gibson组装,转化E.coli TOP10感受态细胞,得到pAd5GBXP质粒。BamHI酶切pAd5GBXP,碱性磷酸酶处理,与11.7kb片段连接,还原得到腺病毒质粒pAd5GXP。PacI线性化pAd5GXP质粒,转染293细胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析证明Ad5GXP基因组不含有PmeI位点。研究结果说明将酶切连接与DNA组装技术相结合,能够方便灵活地对腺病毒基因组进行突变改造。     

纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染

基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV-5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV-11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强.本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV-5对造血细胞感染效率的变化.在前期构建的pKAd5f11p153R-EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入 RGD4C 肽或者 gp120的 V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD-EG、F228RGD-EG、F300RGD-EG、F153CV-EG、F228CV-EG和 F300CV-EG),以fiber未改造的HAdV5-EG和改造为F11p的F11p-EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率.结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5-EG感染效率最低,为2％;其次为F228CV-EG,感染率为45％;F300RGD-EG、F153CV-EG和F300CV-EG感染率为85％～90％;F153RGD-EG、F228RGD-EG高于阳性对照病毒F11p-EG,三者分别为99％、99％、95％.各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5-EG明显低于F11p-EG、F153RGD-EG和F228RGD-EG,当MOI为100时分别为75％、93％、93％和96％.感染K562细胞的情况与U937细胞类似.各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD-EG和F300CV-EG的转导效率为28％和33％,是F11p-EG的10倍.对于人原代T细胞,F153RGD-EG和F228RGD-EG优于F11p-EG,当MOI为1000时,感染率分别为87％、90％和84％.研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV-5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV-11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点.     

人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。     

人腺病毒41型纤维丝状包涵体免疫电镜研究

为明确人腺病毒41型(Adenovirus type 41,Ad41)形态发生过程中形成的纤维丝状包涵体(Fibrillous inclusion body,FIB)是否含有Ad41的长纤维(Long fiber,LF)蛋白与短纤维(Short fiber,SF)蛋白。我们分别原核表达和纯化Ad41LF、SF的球部(Knob)蛋白,分别命名为LFK与SFK。以LFK和SFK分别免疫BALB/c小鼠,分别获得LFK抗血清和SFK抗血清。Western blot、间接免疫荧光和免疫负染结果表明,LFK抗血清和SFK抗血清分别与LF和SF结合,LFK抗血清和SFK抗血清之间无交叉反应,可以应用于免疫电镜标记。通过Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清分别对FIB进行免疫电镜胶体金标记,表明Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清均能标记FIB,说明FIB中含有Ad41长纤维蛋白和短纤维蛋白。