乙型脑炎病毒SA14—14—2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.     

马立克氏病病毒gB部分基因的原核表达

利用PCR技术扩增获得马立克氏病病毒(MDV)囊膜糖蛋白B(gB)基因部分片段,将其克隆入pET-28a载体中,获得表达载体pET-gB,将该载体转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体的效价为1×10-5。此外,通过Western blot实验表明,该抗体具有较高的特异性,为进一步探讨MDVgB所引起的特异的免疫反应奠定基础。     

SUMO化: 一种重要的体内翻译后蛋白质修饰系统

靶蛋白被小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰已经成为真核细胞特有的翻译后蛋白质修饰标志之一.SUMO与靶蛋白之间这种可逆的共价连接,在核质运输、DNA与蛋白质结合活性、蛋白质之间相互作用、转录调控、DNA修复以及维持基因组稳定等方面均发挥着重要的调节作用.在许多人类疾病如癌症和神经退化性疾病中,SUMO化修饰作用对疾病的发生与发展起着极为重要的作用.阐明SUMO化修饰在这些疾病中的功能,将为疾病的治疗开辟一条崭新的思路.     

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病（MD）是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型（Marek＇s disease virus serotype 1,MDV1）引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制。疫苗株分为三种类型：致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型（MDV2）和天然不致病的火鸡疱疹病毒（HVT）。     

α-疱疹病毒与宿主细胞骨架相互作用的研究进展

α-疱疹病毒复制包括吸附宿主细胞膜、膜融合、穿入与脱衣壳、DNA复制与核衣壳装配、囊膜形成与病毒粒子的成熟释放等过程。为了创造一个有利于自身复制和扩散的细胞环境,α-疱疹病毒进化了多种与宿主细胞相互作用的机制。宿主细胞骨架主要包括微管、微丝和中间纤维,在-疱疹病毒复制过程中发挥重要的作用。α-疱疹病毒是如何利用宿主细胞骨架完成其高效率的复制,而宿主细胞骨架又是在病毒的生活周期中起到何种作用,本文就近年来-疱疹病毒与宿主细胞骨架相互作用做一简单综述,有望为抗病毒治疗提供新的研究思路。     

乙脑病毒E-Hsp70与E-肽连接区对小鼠特异性免疫的比较

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个按基酸残基,研究酵母表达的该乙脑病毒(Japanese encephali-tis uirus)E蛋白主经抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的融合蛋白以及该抗原肽与Hsp70上的一个功能域-太连接区(Peptide binding domain,以下简称BD)融合形成的蛋白,用这三种蛋白分别免疫BALB/c小鼠,以酵母单独表达的E蛋白主要搞原惩一片段免疫作为对照,比较它们对小鼠抗E蛋白主要抗原片段特异性的细胞免疫和体液免疫的影响.采用腹腔内注射蛋白的方法免疫小鼠,主要从IL-2的mRNA水平,淋巴细胞的增殖和抗体滴度过这三个方面进行比较,最后我们得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比E-sp79略好一些,所以在本试验中肽连接区是完全可以区是完全可以代替Hsp70独立先例其佐剂功能.     

乙脑E蛋白与结核杆菌HSP70的融合蛋白对BALB/c小鼠特异性免疫的影响

研究酵母表达的乙脑病毒(JapaneseEncephalitisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )形成的融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹膜内注射蛋白的方法免疫小鼠,以直接免疫E蛋白主要抗原片段和以E蛋白主要抗原片段和单独表达的hsp70两者均以5 0pmol的量进行混合后的蛋白免疫的小鼠作为对照,用半定量RT PCR检测细胞免疫因子IL 2mRNA的水平,IL 2是细胞介导的免疫反应和巨噬细胞激活中的关键分子,MTT法检测淋巴细胞的增殖情况以及通过ELISA检测抗体水平,从这3个方面来评价融合与未融合蛋白以及等量混合后的免疫效果。结果E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70重组后,mIL 2 ,淋巴细胞的增殖以及抗体水平均较重组前明显升高,因此,以乙脑E HSP70融合蛋白免疫能增强小鼠针对E蛋白主要抗原片段的细胞免疫和体液免疫     

氧化苦参碱下调免疫细胞TLR7mRNA的表达

为了探讨氧化苦参碱对免疫细胞Toll-like receptor7( TLR7) mRNA表达的影响,使用CCK-8试剂盒检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞的生长抑制作用.应用荧光定量PCR方法检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA及其下游因子TNF-α mRNA表达的影响;检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7 mRNA及其下游因子MyD88、TRAF-6 mRNA表达的影响.结果显示,氧化苦参碱对RAW264.7细胞的半数抑制率为5.9 mg/mL.氧化苦参碱下调RAW264.7细胞TLR7、TNF-α mRNA表达;下调小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA表达.由此得出,氧化苦参碱可下调免疫细胞TLR7mRNA的表达.     

乙脑E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区融合酵母表达载体的构建

构建乙型脑炎E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70（Mycobacterium tuberculosis heat shock protein70,Mt．hsp70）的肽连接区（Binding domain）基因融合表达载体,利用酵母表达系统,为下一步研究肽连接区是否能增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性作准备。以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建,以酶切位点BamHI连接这2个基因,用电穿孔法转化酵母X-33,Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物。E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区的融合表达载体构建成功,SDS—PAGE显示,其相对分子质量为68kDa,与实际大小相符且为分泌表达,表达量约为97mg／L,经Western印迹验证,抗原性较好。将用同样的酵母表达载体表达的乙脑E蛋白主要抗原片段（另文发表）与上述融合蛋白均以50pmol的量分别对6～8周龄的BALB／c小鼠进行腹膜内注射,3周后进行第二次免疫,从淋巴细胞的增殖和抗体滴度两个方面进行比较,最后得出E—BD融合蛋白在免疫效果方面比乙脑E蛋白主要抗原片段效果要好,在试验中肽连接区可以增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性。     

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病(MD)是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型(Marek'sdisease virus serotype 1,MDV1)引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制.疫苗株分为三种类型:致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型(MDV2)和天然不致病的火鸡疱疹病毒(HVT).