人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Aβ1-42寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体.利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库.经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E coliHB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体.SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L.Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础.     

EGFRvⅢ胞外区基因重组腺病毒的构建及单域抗体的制备北大核心CSCD

本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒,并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库,筛选和制备EGFRvⅢ胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增EGFRvⅢ胞外区基因,并连接pAdTrack-CMV质粒载体,转化含有pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183感受态细胞,获得同源重组质粒转染HEK293A细胞,得到表达EGFRvⅢ胞外区蛋白的重组腺病毒。利用重组腺病毒免疫双峰驼,构建EGFRvⅢ胞外区特异性噬菌体单域抗体库,并以EGFRvⅢ蛋白为筛选抗原,对其进行筛选,对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明获得了表达EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒。构建得到的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库的库容为1.4×109;经过3轮富集和筛选,通过噬菌体ELISA筛选出31个与EGFRvⅢ胞外区蛋白结合的阳性克隆,并对OD450值较高的重组单域抗体E14进行了表达和纯化。经ELISA鉴定,重组单域抗体E14可与EGFRvⅢ胞外区蛋白产生抗原抗体结合反应,具有较高的亲和力。说明制备的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性,且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原活性和免疫学反应性,为今后以EGFRvⅢ为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的实验依据。     

控制性液体复苏治疗严重多发伤的疗效及其对血清炎症因子水平的影响

目的:观察控制性液体复苏治疗严重多发伤的疗效及其对降钙素原(PCT)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)水平的影响。方法:选取2010年12月~2012年12月在我院就诊的多发伤患者64例,随机分为观察组和对照组,每组各32例,对照组予以快速液体复苏,观察组予以控制性液体复苏。观察和比较两组的复苏液体量、复苏1小时乳酸、复苏时间、确定手术时间、住院时间、治愈率和死亡率,以及入院时和治疗后患者的血清PCT、hs-CRP、IL-6和TNF-α水平。结果:治疗后,观察组的复苏液体量、复苏1h乳酸、复苏时间、确定手术时间、住院时间和死亡率较对照组明显降低或减少,而观察组的治愈率较对照组明显提高。两组治疗后血清PCT、hs-CRP、IL-6和TNF-α水平均较入院时明显降低(P0.01),且观察组以上指标的水平显著低于对照组(P0.01)。结论:控制性补液复苏对多发伤的疗效优于快速液体复苏,并可显著降低患者的血清PCT、hs-CRP、IL-6和TNF-α水平。     

抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。     

人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Ab1-42寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库。经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L。Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础。     

老年性痴呆抗体药物研究进展

老年性痴呆(Alzhimer's disease，AD)是一种渐进性神经退化性疾病，其主要表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍，具有非常高的发病率，目前还没有特异性治疗药物。随着世界人口老龄化，AD发病率逐年增高，成为本世纪威胁人类健康最严重的疾病之一。近年来AD的发病机理和药物研究方面都有突破性进展，尤其是制备针对β淀粉样蛋白（amyloid beta protein，Aβ）特异性抗体药物成为AD治疗极具价值的途径。本文主要对以Aβ为主的AD发病机理和针对Aβ的抗体药物的治疗机制、研究现状及进展进行综述，为进一步研发AD治疗药物提供参考。