斜纹夜蛾核多角体病毒Spit119基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF119全长基因(Splt119),将其克隆至5'端有6 × His编码序列的原核表达栽体pQE30上,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/LIPTG诱导下超量表达了一个分子量约28 kD的融合蛋白.经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,免疫新西兰大白兔制备了特异的抗Splt119抗体.Western blotting免疫印迹分析表明,该抗体适合用作Splt119蛋白功能的进一步研究.     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ,Bt)菌株S184中克隆了2.3kb大 vip3A基因并进行了序列分析。将vip3A-S184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19％是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）,斜纹夜蛾（S.litura)和棉铃虫（Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3A-S184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

弗林蛋白酶——一种重要的前体蛋白内切蛋白酶

在真核生物细胞中,许多具有生物活性的多肽和蛋白是在其分泌过程中由前体蛋白经内切蛋白酶切割后激活形成的。弗林蛋白酶（Furin)就是这个内切蛋白酶家族重要成员之一,它可以识别剪切多种蛋白质,如生长因子、血清蛋白、基因金属蛋白酶、受体、病毒囊膜蛋白和细菌外毒 素等。近年来Furin得到了迅速而广泛的研究,本简介了它的表达与加工运输、生物学功能、与病毒侵染的关系,以及它的抑制剂。     

Bt毒素蛋白基因的PCR鉴定及定位

利用合成的cryI、cryIII和cryV基因专一性引物 ,检测了从土壤中分离到的 56株苏云金芽孢杆菌菌株所含的晶体毒素蛋白基因。含有cryI基因的有 7株 ,含有cryIII基因的有 2株 ,同时含有cryI和cryV基因的有 2 1株。斑点杂交及Southern杂交分析表明 ,cryV基因定位于 1 50MD的大质粒上。     

斜纹夜蛾核多角体病毒DNA XbaI 4.0 kb片段锌指蛋白基因及重复序列分析

测定了斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltNPV)中山大学分离株基因组DNAXbaI4.0kb片段全序列 ,该片段包括一个锌指蛋白基因及三个区域的DNA重复序列 (SR1、SR2、SR3)。该锌指蛋白基因读码框为 2 196个核苷酸 ,编码 731个氨基酸的蛋白质 ,分子量为 83 .0 9kD ,该蛋白的等电点为 4.6 1。在其 5′非编码区内有一个杆状病毒早期启动子基序GAGT及一个TATA盒 ,在其终止密码的下游有 5个真核生物转录mRNA时poly(A)加尾信号AATAAA。在 2 2 3～ 2 41氨基酸残基之间有一个锌指蛋白基序 ,这一基序属于锌指蛋白基序中的C3HC4类 ,即环指 (Ringfinger)类基序。在 32 3～ 340氨基酸残基区域为一个核定位信号。该蛋白可能为一个高度折叠的蛋白质。在该片段中存在三个DNA重复序列区域 (SR1、SR2、SR3) ,其中SR1与SR3区域存在更大量的重复序列 ,SR1区域其中的一个重复序列长达 41bp ,SR1、SR3重复序列区域可能作为该病毒转录的增强子 ,或者作为DNA复制的起始点。     

斜纹夜核多角体病毒DNA XbaⅠ4.0kb片段锌指蛋白基因及重复序列分析

测定了斜纹夜核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)中山大学分离株基因DNA XbaI4.0片段全序列,该片段包括一个锌指蛋白基因及三个区域的DNA重复序列（SR1、SR2、SR3）。该锌指蛋白基因读码框为2196个核苷酸,编码731个氨基的蛋白质,分子量为83．09KD,该蛋白的等电点为4．61,在其5‘非编码区内有一个杆状病毒早期启动子基序GAGT5及一个TATA盒,在其终止密码的下游有5个真核生物转录mRNA时poly(A)加尾信号AATAAA。在223－241氨基酸残基之间有一个锌指蛋白基序,这一基序属于锌指蛋白基序中的C3HC4类,即环指（Ring finger)类基序,在323－340氨基酸残基区域为一个核定位信号,该蛋白可能为一个高度折叠的蛋白质。在该片段中存在三个DNA重复序列区域（SAR1、SR2、SR3）,其中SR1与SR3区或存在更大量的重复序列,SR1区域其中的一个重复序列长达41bp,SR1,SR3重复序列区域可能作为该病毒转录的增强子,或者作为DNA复制的起始点。     

杆状病毒SpltMNPVSl136基因的克隆、表达及其产物功能

计算机分析斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV)基因组序列,发现第136个读码框基因表达产物具有病毒囊膜蛋白的基本特征,计算机预测的SL136蛋白氨基酸序列N端具有信号肽,C端具有跨膜区,N端区还有一个许多病毒融合蛋白共有的卷曲螺旋结构。通过PCR扩增,我们克隆了Sl136基因并分别构建了原核表达载体pBVSl136及重组病毒表达载体,SDS-PAGE结果表明Sl136基因在大肠杆菌和昆虫细胞中均获得了较高的表达,另外,我们还构建了一个瞬时表达载体pUCSl136。单独转染Sl-zsu-1细胞后,低pH值环境可诱导细胞发生膜融合并形成合胞体,这些实验结果表明,Sl136基因表达的产物是一个病毒膜融合蛋白。     

斜纹夜蛾泛素基因的克隆及表达

泛素介导的蛋白质降解途径对脑内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对简并引物,从斜纹夜娥(Spodoptera litura)细胞中克隆了泛素基因的编码区,CenBank登录号AF436066。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8．56kD的蛋白,其等电点为6．56。同源性比较发现,斜纹夜峨泛素基因不仅与其它真核生物的泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性,而且与斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltMNPV)泛素基因的同源性为84％。RT—PCR分析发现,泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织,尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB,在大肠杆菌M15中诱导并高效表达出了带有His—tag的重组融合蛋白,薄层扫描分析得知靶蛋白约占总蛋白的37％。利用Ni—NTA亲和层析胶纯化得到重组融合蛋白,经SDS—PAGE鉴定为单一区带,为进一步研究S．litura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。     

SZZ-Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定*

PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素 (harpin)融合蛋白的 1 5kb基因片段 ,克隆到苏云金杆菌 (^{Bacillusthuringiensis} ,Bt)表达载体pHZB1上 ,并置于晶体蛋白cry1类基因的启动子下游 ,从而构建表达质粒pHSZH。将表达载体pHSZH电激转化晶体缺陷型的BtK CryB菌株 ,获得工程菌Bt pHSZH。SDS PAGE蛋白分析和生物测定结果显示 ,培养 4 8h的Bt pH SZH明显表达SZZ Harpin融合蛋白 ,表达产物具有诱导烟草     

重组杆状病毒生物杀虫剂的研究进展

重组杆状病毒生物杀虫剂的研究进展农广,庞义（中山大学生命科学学院生物防治国家重点实验室,广州５１０２７５）目前,发展安全有效、替代化学农药的生物杀虫剂是害虫防治的主要趋向。杆状病毒是ＷＨＯ推荐的一种生物杀虫剂,它具有以下优点：是昆虫的病原体,对脊椎动...