脂质体介导基因编辑载体质粒转染条件的优化

[目的]探讨脂质体介导基因编辑载体质粒转染人食管癌Eca-109细胞的最佳条件。[方法]以基于Cre/Lox P系统的p GT-A1B1和基于CRISPR/Cas9系统的p X458-sgRNA8两种基因编辑载体质粒为实验材料,将环状和线性质粒以不同DNA用量(0. 2、0. 4、0. 6和0. 8μg)和不同DNA与脂质体比例(1∶1、1∶1. 5、1∶2、1∶2. 5和1∶3)转染Eca-109细胞,计算转染效率。[结果]不同DNA用量条件下,p GT-A1B1在0. 4μg和0. 6μg时转染效率较高,p X458-sgRNA8在0. 6μg时转染效率较高,与其它DNA用量比较均有显著性差异(P 0. 05)。不同DNA与脂质体比例条件下,p GT-A1B1在比例为1∶1. 5和1∶2时转染效率较高,p X458-sgRNA8在比例为1∶2. 5时转染效率较高,与其它比例比较均有显著性差异(P 0. 05)。同一种质粒的环状和线性结构形态,在DNA用量或DNA与脂质体比例相同时,转染效率差异不显著(P 0. 05)。[结论]建立了脂质体介导基因编辑载体质粒转染Eca-109细胞的最佳转染条件,质粒p GT-A1B1和p X458-sgRNA8的DNA用量分别为0. 4～0. 6μg和0. 6μg,DNA与脂质体比例分别为1∶1. 5～1∶2和1∶2. 5。     

小麦种子过氧化物酶WP1 基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

WP1是小麦种子中最主要的阳离子过氧化物酶,该酶不仅参与种子的发育过程,而且影响面粉的加工品质。首先构建了WP1基因原核表达载体pET28a-WP1,并将其转化到T7 Expression大肠杆菌菌株中诱导表达。His-tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化,获得纯度大于98％的重组蛋白。重组WP1经尿素梯度透析复性溶解后免疫新西兰大白兔,最终获得WP1多克隆抗体。ELISA分析结果显示制备的WP1兔抗血清的效价大于1∶625 000;Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对WP1具有很好的专一性。     

小麦CEN/TFL1-like cDNA克隆及其编码序列分析

以水稻、金鱼草、拟南芥CEN/TFL1蛋白质序列为参考,以小麦中CEN/TFL1基因同源EST片段为依据设计特异引物,利用RT-PCR从普通小麦‘中国春’幼穗总RNA中扩增出549 bp的特异片段。测序结果表明,该片段包含了完整的ORF,编码产物为典型的CEN/TFL1-like蛋白家族成员。序列比对表明,该基因编码产物与黑麦草LpTFL1、水稻FDR2和FDR1以及玉米ZmTFL1亲缘关系最近,分别具有96.5%、96.0%、93.6%和95.4%的相似性;与哺乳动物Rattus norveqicus磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)具有38.9%相似性。空间结构预测表明,该蛋白具有PEBP家族成员的典型三维结构。     

两种HMW-GS基因启动子片段的克隆及分析

利用聚合酶链反应(PCR)技术从小偃6号中获得400bp左右的扩增产物,将其与pGEM-T Easy载体连接后转入大肠杆菌,经过筛选获得HMW-8-P和HMW-38-P两种类型克隆。序列分析表明：HMW-38-P包括了HMW-GS14基因上游启动子及信号肽对应编码区,而另一段(HMW-8-P)为一未知HMW-GS基因启动子区及信号肽对应的编码区。将两序列和GenBank中已知的35种HWM-GS基因启动子区序列进行多序列比对,最后获得HMW-GS启动子的系统发生树。通过系统发生树可以清晰地看出位于不同染色体上的不同亚基类型的HMW-GS基因的进化关系,并可确定HMW-8-P为Glu-D-1类型HMW-GS的启动子区,小偃6号中Glu-D-1类型的亚基为2亚基,所以HMW-6-P为2亚基启动子区序列。     

拟南芥atslA基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出atslA基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,atslA基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

植物甜蛋白brazzein基因的克隆与表达

根据大肠杆菌偏爱的密码子,利用PCR技术体外人工合成brazzein cDNA序列,并将其克隆至原核高效表达载体pET30a( )中。重组载体pET30a( )-brazzein转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果证明pET30a( )-brazzein在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白25％左右。     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

产甲烷菌研究进展

产甲烷菌是重要的环境微生物,在自然界的碳素循环中起重要作用。迄今已有5种产甲烷菌基因组测序完成。基因组信息使人们对产甲烷茵的细胞结构、进化、代谢及环境适应性有了更深的理解。目前已知的甲烷生物合成途径有3种,它们以乙酸、甲基化合物、氢/二氧化碳为起始,通过不同的反应途径都形成了甲基辅酶M,在甲基辅酶M还原酶的催化下最终形成甲烷。     

BCAT4、CYP79F1和ESM1过表达提高西兰花细胞萝卜硫素含量

萝卜硫素(sulforaphane,SFN)是目前防癌抗癌效果最好的植物天然产物之一。十字花科芸薹属植物西兰花是生产SFN的重要材料。然而普通西兰花中SFN产量仍无法满足巨大的市场需求。之前单一基因改造提高植物SFN含量的策略效果并不理想。该研究从西兰花中克隆了SFN合成相关的支链氨基酸转移酶4编码基因BCAT4、细胞色素P450氧化酶编码基因CYP79F1和环硫修饰酶编码基因ESM1。分别以单基因导入和三基因串联导入的方式,通过农杆菌法转化西兰花愈伤组织,对所获得的转化细胞系中SFN的含量进行比较,以期获得SFN含量更高的细胞系,为通过细胞系大量培养获取SFN奠定基础。实验结果表明,目的基因BCAT4、CYP79F1、ESM1和B-C-E(BCAT4NSCYP79F1N-SESM1)都成功整合于宿主细胞基因组。BCAT4和B-C-E基因过表达细胞系中SFN含量为139.7和171.4μg/g,分别是野生型细胞系SFN含量的1.79倍和2.19倍,差异极显著(**P<0.01);B-C-E基因过表达细胞系SFN含量是BCAT4基因过表达细胞系的1.23倍,差异显著(*P<0.05)。而CYP79F1和ESM1过表达细胞系未检测到高于对照的SFN含量。综上所述,单基因BCAT4的过表达对SFN含量的影响大于CYP79F1与ESM1。多基因串联共表达对SFN含量的影响效果好于单个基因的过表达。