pBV220/hIL-4优化表达及其包涵体复性研究

旨在对人白细胞介素-4(hIL-4)上、下游序列进行优化设计,提高在原核系统中的表达量,并对表达的包涵体进行复性研究提高复性率.利用BioSun的RNA二级结构预测模块辅助设计hIL-4起始密码子(AuG)上、下游的序列,使局部二级结构的自由能满足高表达要求;根据pBV220栽体和原核系统的特点优化引物序列提高hIL-4原核表达量.优化hIL-4包涵体复性条件和方法,提高复性率和生物活性.结果显示,成功构建了pBV220/hIL-4高效表达栽体,原核表达的重组人IL-4占细茵总蛋白的35%以上,明显高于优化前表达量;经过复性研究hIL-4包涵体复性率可达到15%以上,生物活性鉴定发现,纯化的hhIL-4蛋白的比活等同或高于国外同类产品.影响原核表达的条件较多,对表达序列的优化设计可以大大提高蛋白的表达量.针对人IL-4基因序列的优化设计提高了人IL-4基因的表达,复性方法的改良提高了复性率和生物活性.     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

Smad7基因在细胞恶性转化过程中的促增殖作用

用基因转染的方法,建立稳定表达Smad7基因的永生化及恶性化人支气管上皮细胞系,用MIT法检测Smad7基因过表达对细胞生长、增殖的影响及对RFD-β1介导的生长抑制效应的影响。结果表明在永生化和恶性化人支气管上皮细胞系BEP2D和BERP2D和BERP35T2中各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的克隆,命名为BS7-1、BS7-2(来源于BEP20),RS7-1、RS7-2(来源于BERP35T2)。这些细胞系细胞的生长、增殖能力均强于转染空载体的对照细胞系,同时TG-β1对这些细胞系的生长抑制能力明显减弱。提示Smad7基因通过降低细胞对形TGF-β的应答来促进细胞的生长、增殖能力。     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

目的：用原核系统表达结核分枝杆菌Rv3425蛋白并纯化,评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板,PCR扩增得到Rv3425基因序列,克隆至表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达后纯化,用Western印迹和ELISA法进行抗原性初步评价。结果：在原核系统内经IPTG诱导表达后,Rv3425蛋白主要以包涵体形式存在,经复性和镍柱层析纯化后,纯度达95%以上;Western印迹和ELISA结果证明重组Rv3425具有较强的抗原活性;用纯化的Rv3425蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达50%。结论：高纯度的Rv3425蛋白在结核病诊断方面具有很高的应用价值,可作为结核病诊断的备选抗原。     

MTT实验检测重组人角质细胞生长因子-2诱导不同细胞系增殖的差异

目的:用MTT法检测重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)诱导不同细胞系增殖的差异,建立验证rhKGF-2生物活性的细胞模型.方法:利用载体pBV220-KGF-2原核表达和纯化rhKGF-2,然后用MTT法分别检测rhKGF-2诱导大鼠气管上皮细胞RTE、大鼠小肠上皮细胞IEC-6、小鼠成纤维细胞NIH/3T3...     

结核分枝杆菌Rv3881c突变子的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原,以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用,有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法：将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达;由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达,使用Ni-柱进行快速纯化。结果：Western印迹表明,重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论：重组Rv3881c突变体具有较好的特异性,提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。     

直接转基因技术应用于神经系统基因治疗的研究进展

神经系统疾病的基因治疗是目前神经科学中发展比较迅速的一个领域,近年来研究发现,一此来源于单纯疱疹病毒,腺病毒和腺病毒相关病毒等的重组病毒表达载体能够将外源基因直接导入在体或离体培养的神经细胞。     

结核分枝杆菌HspX蛋白的原核高效可溶性表达及产物抗原性分析

目的:利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌HspX蛋白并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增HspX核酸序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western印迹初步评价HspX的抗原性。结果:经IPTG诱导,HspX蛋白在原核系统内获得了可溶性表达,经镍柱亲和层析获得了纯度达95%以上的重组蛋白。Western印迹结果证明重组HspX蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论:重组蛋白HspX在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

人白介素-4与大肠杆菌二硫键异构酶DsbC在大肠杆菌中的融合表达及羟胺切割后共复性

目的:通过融合表达、羟胺切割、与二硫键异构酶共复性,获得高表达、高纯度、高生物活性的重组人白细胞介素-4(rhIL-4)。方法:将5端引入了羟胺切割位点的hIL-4基因克隆到大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的原核表达载体pET-DsbC中,IPTG诱导表达,对包涵体进行纯化,然后在变性条件下经羟胺切割,利用DsbC的分子伴侣功能与hIL-4进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得rhIL-4蛋白。结果:融合蛋白DsbC-hIL-4的表达量占细菌总蛋白的40%以上,以包涵体形式存在;纯化后得到的rhIL-4的相对分子量为15×103,与预期一致,电泳纯度达95%;细胞学实验测定其具有良好的生物学活性。结论:通过融合表达的方法可以提高hIL-4的原核表达量;利用共复性的方式极大地提高了hIL-4的复性率和生物活性。     

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。