单头灰飞虱体内水稻条纹叶枯病毒的快速检测

利用RT-PCR检测感病植株和单头带毒灰飞虱,均扩增出水稻条纹叶枯病毒特有的一个长540 bp的片段,且人工饲毒虫的病毒含量高于自然感病稻田虫。以病毒S蛋白的多克隆抗血清,采用Western印迹技术从单虫体内检测到病毒抗原的2个专一性条带,大小分别为20.7和19.7 kDa。DIBA（dot immunobinding assay）检测法快速、简便,但专一性和灵敏度不及RT-PCR与Western印迹检测。对不同检测方法所得昆虫带毒率差异的原因进行了探讨。     

表达猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

目的:构建并筛选表达猴免疫缺陷病毒(SIV)Env蛋白的重组鸡痘病毒(FPV),并对其进行鉴定。方法:设计引物,通过PCR技术扩增SIV env基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的FPV穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-SIV env,然后将其与FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR、RT-PCR、Western印迹对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组FPV基因组中,RT-PCR、Western印迹结果表明SIV Env蛋白在感染细胞内表达且具有抗原性;连续传代20次,PCR、RT-PCR、Western印迹均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,且病毒已经纯化。结论:获得表达SIV Env蛋白的重组FPV,为进一步免疫试验研究奠定了基础。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建高效抑制核磷蛋白NPM1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰载体。方法:以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体pll3.7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其与慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HT1080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果:酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HT1080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPM1的表达显著降低。结论:构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPM1的表达,为NPM1功能的研究提供了有力工具。     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

本研究首次用RT-PCR技术分两段扩增了我国猪瘟病毒(HCV)标准强毒石门株的主要保护性抗原E2基因,并将其进行了克隆和序列分析。将这两个片段连接成完全的E2基因,并将其克隆到原核表达载体pBV220和pET-28a( )中,重组表达载体转化、诱导的受体菌经Western印迹和直接ELISA检测能够表达E2抗原。 用RT-PCR技术对从我国多个地区收集的猪瘟病料进行检测,结果从吉林、长春、南京、重庆、昆明、佛山病料中扩增出了HCV E2保     

抗病基因Bdv2抑制大麦黄矮病毒复制和运动的分子证据

小麦-中间偃麦草易位系YW642含有一个源于中间偃麦草7X染色体的抗性基因Bdv2,对大麦黄矮病毒GAV株系具有高度抗性。为有效控制该病毒和阐明抗黄矮病机制,采用半定量RT-PCR的方法,研究了大麦黄矮病毒GAV株系在YW642及其感病姊妹系YW641中积累浓度的差异。分别在接种病毒不同时间、不同部位上取样,用半定量RT-PCR的方法来检测GAV的积累浓度。在接种部位,抗病植株中病毒的浓度远远低于感病植株。在侵染的前5d,抗病植株YW642中病毒会有一定程度的复制和积累,但随后病毒浓度开始下降,接种14—16d时没有检测到病毒;而在感病株系中,病毒积累的浓度远远高于抗病植株,并一直维持一个较高的浓度。在未接种部位．感病植株中可检测到较高浓度的病毒,说明病毒能从接种点很快运动到未接种部位,并大量复制。而在抗病系YW642中,未接种部位始终未检测到病毒。实验结果从分子水平上证明,在抗病植株中BYDV的复制和运动均受到了极大的抑制：这是抗病基因Bdv2与BYDV互作后,激活了一系列防御基因的结果。另外还确定了防御基因诱导表达的时间,为从抗病植株中分离抗病相关基因、研究抗黄矮病机制提供了取样的依据。     

慢病毒介导RNA干扰HPIP蛋白抑制肿瘤细胞增殖

目的:建立高效稳定的造血相关的PBX相互作用蛋白质(HPIP)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,检测HPIP的表达对肿瘤细胞生长增殖的影响。方法:构建人HPIP慢病毒siRNA干扰载体,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测Lenti-H1 HPIP siRNA的干扰效果;将Lenti-H1 HPIPsiRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞,包装成慢病毒后,感染宫颈癌HeLa和肝癌HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹检测;用结晶紫实验检测其对肿瘤细胞生长增殖的影响。结果:构建的Lenti-H1 HPIP siRNA能有效抑制HPIP的表达;结晶紫实验显示,慢病毒介导的HPIP siRNA导致细胞增殖的显著抑制。结论:慢病毒介导的HPIP敲减能明显抑制肿瘤细胞的增殖,HPIP可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点。     

番木瓜抗病突变体阻碍环斑病毒体内运转

应用RT-PCR一步法检测了PRSVYs株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,结果表明在感病植株中,接种后48hr接种叶的未接种部位可检出病毒,第4天部分接种叶柄可检出病毒,第6天植株各部位均能检出病毒;而在抗病植株中,接种后可以而且仅能在接种部位检出病毒;因而认为抗病突变体能够阻碍病毒从接种部位运出及（或）向未接种部位运入。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1。将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达。经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡。     

灰飞虱中IKK相关基因的鉴定及其在水稻条纹病毒侵染中的功能

【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK 1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开放阅读框长2379 bp,编码792个氨基酸;TBK 1开放阅读框长1551 bp,编码516个氨基酸。两个基因编码的蛋白都具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和1个泛素折叠结构域。RT-PCR结果表明,IKKα和TBK 1在无毒灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中均有表达。qRT-PCR分析结果表明,IKKα和TBK 1在RSV侵染后的灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中的表达水平与其在无毒灰飞虱中的表达量之间存在明显差异。进一步将RSV侵染后的灰飞虱3龄若虫中的IKKα和TBK 1干扰后,带毒灰飞虱中的RSV含量显著上升。【结论】本研究结果表明,NF-κB信号途径中的两个重要基因IKKα和TBK 1在灰飞虱中广泛表达,且在灰飞虱抵御RSV的侵入过程中可能具有重要功能。这些结果为今后进一步深入研究NF-κB免疫通路在灰飞虱抗病毒中的功能提供了丰富的基础信息。     

沃尔巴克氏体在中国三种稻飞虱中的感染

用PCR方法检测了采集于不同地域稻田的3种稻飞虱共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)的感染,发现灰飞虱Laodelphax striatellus、褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera为沃尔巴克氏体所感染。克隆了编码沃尔巴克氏体外膜蛋白质的wsp基因并进行了序列测定。对wsp的RFLP分析证实了这些飞虱为单一沃尔巴克氏体感染。研究了灰飞虱中沃尔巴克氏体所诱导的胞质不相容性及其在不同地域灰飞虱中的分布。还发现能寄生于上述3种飞虱的稻虱红螯蜂也受同种沃尔巴克氏体感染。沃尔巴克氏体可能通过这种寄生蜂在不同昆虫间横向传播。     

Expression of Rice Stripe Virus Coat Protein Gene in Transgenic Rice Plants

Rice stripe virus (RSV) is a pathogen of rice stripe disease causing great damage to rice. The disease is transmitted by Laodelphax striatellus and three other planthoppers. RSV infects as much as 37 cereals including rice, wheat, maize and results in a significant reduction in yield in epidemic year. In order to develop efficient means of controlling the disease, authors have studied the amino acid composition of RSV coat protein (CP), synthesized and cloned the cDNA to CP, sequenced the full-length CP gene. Having inserted the RSV CP gene into plant expression vector pROK Ⅱ, authors transformed rice suspension culture via microprojectile bombardment and obtained transgenic plants expressing the CP gene. The suspension culture was initiated by inoculating yellowish, compact and embryogenic calli derived from seeds into suspension medium containing proline and maltose. After being cultured at 26℃ in the dark for about half a year, finely-dispersed and embryogenic suspension culture was estabolished. Before bombardment the suspension culture was evently applied onto three-layered filter-paper discs in a petri dish. CaCl2 and spermidine was employed to coat tungsten particle with plasmid DNA. 2.5 μl of coated particle was loaded onto bullet and each dish was bombarded three times. Immediately after being bombarded, the suspensions were cultured in modified N6 medium. 2 days later the suspensions were transferred to the same medium but containing G418, which were subcultured weekly. Being subject to G418 selection for two months, white and fast-growing clones were emerged from the brownish cultures. Green plants regenerated when the resistant calli were transferred to differentiation medium. The regenerated plants were firm enough to grow well in the greenhouse. 10 plants regenerated from G418 resistant calli were tested for their transformed nature by Southern blot using 32P-labelled CP gene as a probe. Among the plants tested, 2 plants showed clearly hy bridizing bands with a molecular weight corresponding to RSV CP gene. Western blot further demonstrated that RSV CP gene was expressed in transgenic rice plants. At present tests on the antiviral effects of transgenic plants by feeding plantphoppers infccted with RSV are being underway.     

三种稻飞虱体内类酵母共生菌18S rDNA和 ITS 5.8S rDNA序列克隆及进化分析

为研究水稻3种主要害虫灰飞虱Laodelphax striatellus、 褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera体内类酵母共生菌（yeast-like symbiotes, YLS）的种属地位及与寄主的进化关系, 测定了其体内YLS的18S rDNA及ITS-5.8S rDNA的全长序列。基于3种稻飞虱体内YLS的18S rDNA序列比对表明, 褐飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与灰飞虱YLS的高（褐飞虱YLS和白背飞虱YLS为98.91%, 灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为95.74%, 灰飞虱YLS和白背飞虱YLS为96.02%）, 而基于ITS-5.8S rDNA序列比对, 灰飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与褐飞虱YLS的要高（白背飞虱YLS和灰飞虱YLS为99.57%, 灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为91.91%, 白背飞虱YLS和褐飞虱YLS为90.46%）。基于真菌18S rDNA和ITS-5.8S rDNA的系统发育树均表明, 3种稻飞虱体内YLS与其他已知真菌进化关系较远。本研究证实了昆虫真菌类共生菌与寄主形成了长期的进化关系, 从而形成了不同于已知真菌的分类地位。     

稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律研究

【目的】明确稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律,以指导其大田迁入种群和迁出种群的发生预测与灾变预警。【方法】本研究运用逐时自动灯诱装置对2010和2011连续两年稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律进行了系统研究。【结果】灰飞虱Laodelphax striatellus迁飞种群上灯始见期和灯诱虫量年际间差异不明显,白背飞虱Sogatella furcifera和褐飞虱Nilaparvata lugens迁飞过境种群上灯始见期和灯诱虫量年际间差异较大。此外,灰飞虱迁飞种群的特大高峰期和高峰期逐时灯诱虫量百分比与一般上灯期和零星上灯期相比突出了晨暮双峰型中的暮峰型上灯行为特点;白背飞虱迁飞种群特大高峰期逐时灯诱虫量百分比与高峰期和一般期相比突出了晨暮双峰型中的晨峰型生物学特性。【结论】稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律存在种的特异性,这一行为节律除了受环境因素的影响外主要与其生物学特性有关。     

Five proteins of Laodelphax striatellus are potentially involved in the interactions between rice stripe virus and vector

Rice stripe virus (RSV) is the type member of the genus Tenuivirus, which relies on the small brown planthopper (Laodelphax striatellus Fallén) for its transmission in a persistent, circulative-propagative manner. To be transmitted, virus must cross the midgut and salivary glands epithelial barriers in a transcytosis mechanism where vector receptors interact with virions, and as propagative virus, RSV need utilize host components to complete viral propagation in vector cells. At present, these mechanisms remain unknown. In this paper, we screened L. striatellus proteins, separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), as potential RSV binding molecules using a virus overlay assay of protein blots. The results, five L. striatellus proteins that bound to purified RSV particles in vitro were resolved and identified using mass spectrometry. The virus-binding capacities of five proteins were further elucidated in yeast two-hybrid screen (YTHS) and virus-binding experiments of expressed proteins. Among five proteins, the receptor for activated protein kinase C (RACK) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH3) did not interact with RSV nucleocapsid protein (NCP) in YTHS and in far-Western blot, and three ribosomal proteins (RPL5, RPL7a and RPL8) had specific interactions with RSV. In dot immunobinding assay (DIBA), all five proteins were able to bind to RSV particles. The five proteins' potential contributions to the interactions between RSV and L. striatellus were discussed. We proposed that RACK and GAPDH3 might be involved in the epithelial transcytosis of virus particles, and three ribosomal proteins probably played potential crucial roles in the infection and propagation of RSV in vector cells.     

红眼突变灰飞虱的生物学特性和交配优势

灰飞虱Laodelphax striatellus是我国重要水稻害虫之一, 表型变异可能影响灰飞虱的配偶选择性和种群特性。本实验采用生命表构建法研究了红眼突变灰飞虱的繁殖力、 内禀增长率等种群生命参数, 然后以1红眼雌虫、 1红眼雄虫和1纯合黑眼雄虫（♀rr×♂rr♂BB）或1红眼雄虫、 1红眼雌虫和1纯合黑眼雌虫（♀rr♀BB×♂rr）配对模式以及不同比例红眼成虫群体配对模式研究红眼突变对灰飞虱交配竞争力的影响。结果表明红眼突变灰飞虱除若虫死亡率（17.1%）显著高于正常个体（10.3%） (P<0.05)外, 其他生物学指标如繁殖力、 卵孵化历期、 若虫发育历期、 成虫寿命、 内禀增长率等与正常个体无显著差异。但红眼突变对灰飞虱配偶选择性有一定的影响。♀rr×♂rr♂BB和♀rr♀BB×♂rr组合F1代红眼和黑眼分离比例卡方试验值为18.15和14.99, 大于理论值。当红眼与黑眼个体以2︰8比例配对时, 红眼灰飞虱雄虫存在交配优势, 其后代红眼个体数大于期望值。这些结果为进一步研究灰飞虱红眼突变机理和利用红眼基因标记研究灰飞虱遗传分化奠定了基础     

黄色诱虫板对稻飞虱的诱集和防治效果

【目的】评价黄色诱虫板对稻飞虱的控制作用,为稻飞虱的非化学防控提供科学依据。【方法】在田间悬挂黄色诱虫板,调查稻飞虱的诱集情况,并同盘拍结果进行比较。【结果】上海水稻白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)成虫的发生高峰期集中在8月下旬;而灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallén)和褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)成虫发生高峰期主要集中在9月中旬。从3种稻飞虱成虫的发生动态来看,灰飞虱发生最为严重,黄色诱虫板最高诱集数为(6.12±4.50)头/(天·板),每板每天平均诱集成虫数大于等于2头的有18个水稻品种,其余6个水稻品种诱集的成虫数虽然少于2头,但是都能诱集到成虫;其次是白背飞虱,最高诱集数为(2.29±0.13)头/(天·板),每板每天平均诱集成虫数大于等于1头的有7个水稻品种,其余17个水稻品种诱集的成虫数虽然少于1头,但是都能诱集到成虫;再次是褐飞虱,最高诱集数为(1.50±1.85)头/(天·板),每板每天平均诱集成虫数大于等于1头的有1个水稻品种,其余23个水稻品种诱集的成虫数均少于1头,其中3个水稻品种在10月中旬均没有诱集到1头成虫。总体而言,黄色诱虫板对3种稻飞虱的最高诱集数为(7.50±4.36)头/(天·板),每板每天平均诱集成虫数大于等于2头的有23个水稻品种,仅1个水稻品种诱集的成虫数少于2头。黄色诱虫板下部离水稻冠层越近,诱集的成虫越多。【结论】黄色诱虫板对稻飞虱成虫具有较好的诱杀效果,可有效降低成虫种群数量。作为一种非化学防控方法,黄色诱虫板的使用可有效降低化学杀虫剂的使用量。