猪瘟兔化弱毒E2基因序列测定与分析

采用微量法(100μl)从牛睾丸细胞培养液中提取猪瘟兔化弱毒(HCLV)RNA,成功地用于RT-PCR扩增。采用Taq Track Sequence System试剂盒方法,用Bio-Rad Model 300 Xi DNA测序仪直接用PCR产物进行序列测定。经过反复多次的序列测定,HCLV E2基因的全部序列已被证实。该序列已被国际基因库(GeneBank)收录,编号为U72048。 将测定的HCLV囊膜糖蛋白E2基因序列输入计算机,采用DNAsis软件与日本的GPE株、ALD株和欧洲的Brescia株、Alfort株猪瘟     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

本研究首次用RT-PCR技术分两段扩增了我国猪瘟病毒(HCV)标准强毒石门株的主要保护性抗原E2基因,并将其进行了克隆和序列分析。将这两个片段连接成完全的E2基因,并将其克隆到原核表达载体pBV220和pET-28a( )中,重组表达载体转化、诱导的受体菌经Western印迹和直接ELISA检测能够表达E2抗原。 用RT-PCR技术对从我国多个地区收集的猪瘟病料进行检测,结果从吉林、长春、南京、重庆、昆明、佛山病料中扩增出了HCV E2保     

牛病毒性腹泻病毒P125基因重要区的比较与分析

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)为黄病毒科瘟病毒属中的成员。根据在细胞培养物中是否产生病变,可将BVDV分为致细胞病变(CP)和非致细胞病变     

猪瘟病毒反义基因在培养细胞上的效应研究——反义基因对猪瘟病毒的抑制作用

应用免疫荧光抗体技术检测了整合有猪瘟病毒反义基因的PK-15细胞克隆对猪瘟病毒的抑制效应。结果表明,五个不同的反义基因片段对猪瘟病毒的抑制效率存在很大差异,其中A片段的抑制效率最高(94％～98％),B片段次之(58％～76％),C片段再次(～64％),D片段和E片段未见明显的抑制效应。抑制效率的差异可能与反义基因片段的位置、长短以及反义RNA表达质粒载体的差异有关。     

兔防御素（MCP—1）cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总ＲＮＡ,经反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽（ＭＣＰ－１）ｃＤＮＡ,插入经ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｂａ Ｉ双酶切的ｐＵＣＤ１９中,构建了党生质粒ｐＵＣＤＥＦ,进行了限制性酶切鉴定和序列分析,结果在扩增出的ｃＤＮＡ２８８个碱基中,在前片段中有一个碱基与发表的兔ＭＣＰ－１ ｃＤＮＡ序列不同,即第１５７位碱基由Ｇ变为Ａ,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。该ｃＤＮＡ全     

兔防御素(MCP-1)cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总RNA,经反转录PCP(RT-PCR)扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽(MCP-1)cDNA,插入经EcoRI和XbaI双酶切的pUC19中,构建了克隆质粒pUCDEF.进行了限制性酶切鉴定和序列分析,结果在扩增出的cDNA288个碱基中,在前片段中有一个碱基与发表的兔MCP-1cDNA序列不同,即第157位碱基由G变为A,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸.该cDNA全长288bp,编码94个氨基酸,由编码信号肽,前片段及成熟肽片段的序列组成.     

Ri质粒介导的DNA转移及诱发甘草毛根再生植株

本文报道了通过三亲交配将PB1121双元中间载体从大肠杆菌C600转移到发根农杆菌R1000(PRiA4b)中,在含Km、Sm的MinA选择平板上获得了转移子,上述转移子菌液用注射法感染甘草胚轴、茎等外植体,在无激素含1mg/mlcb,0.1mg/mlkm的MS培养基上培养,两周后诱发出毛根,切下毛根在同上培养基上6周长出不定芽,继续培养长成再生植株,经检测转化株毛根中存在甘露碱和GUS基因产物,具有Km抗性和激素自主性生长特性,证明Ri质粒不仅可介导GUS基因转移还可诱发毛根再生植株,提供了简化、高效的植物遗传转化系统。     

271份豌豆种质资源农艺性状遗传多样性分析

以来自五大洲57个国家和地区的271份豌豆资源为材料,利用主成分分析和聚类分析的方法,评价其2个质量性状和7个数量性状的遗传变异水平。结果表明,参试资源的农艺性状具有丰富的遗传多样性。其中遗传多样性指数最高的是始荚节位(2.0590),其次是主茎节数(2.0421);性状变异系数最大的是小区产量(64.874%),其次是百粒重(61.870%)。采用SPSS 22.0软件对参试资源7个数量性状的主成分分析结果表明,前3个主成分因子累计贡献率达66.021%,Ward法聚类将参试的271份豌豆资源划分为4大类群,其中第Ⅱ类群属于高秆、大粒、高产种质,具有很高的丰产潜力,为我国杂交育种亲本选择提供了原材料。对取材数大于等于5的来自于四大洲17个国家的参试资源进一步分析发现,不同地理区域资源间遗传变异显著,其中印度的遗传多样性指数最高(1.7533),巴基斯坦的最低(0.9685),波兰的变异系数和遗传多样性都较高。综合分析国外种质资源的农艺性状,有助于我国豌豆育种项目亲本选配。     

大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达

目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

中国猪瘟兔化弱毒(兔血源毒)NS_3 5′端基因的克隆与序列分析

猪瘟 (ＨｏｇＣｈｏｌｅｒａ ,ＨＣ ;或称为ＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒ ,ＳＦ)是猪最重要的传染病之一 ,猪瘟病毒(ＨＣＶ或ＳＦＶ)归类于黄病毒科瘟病毒属。在现行疫苗中 ,猪瘟兔化弱毒疫苗 (ＨＣＬＶ)是最广泛使用的疫苗之一 ,ＨＣＬＶ是由中国兽药监察所研制成功的猪瘟弱毒疫苗 ,赠给许多国家后 ,被适应于许多细胞 ,国外一律称为Ｃ株。 80年代后 ,我国猪瘟兔化弱毒组织苗也换代为羊肾、牛睾丸、羊睾丸等组织细胞苗。但国内外应用单克隆抗体对Ｃ株检测发现有不同的反应模式 ,表明经过多年在不同细胞驯化的结果 ,Ｃ株已经名同实异[1,2 ] 。正是在…