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旨在原核表达Smad4基因,纯化获得GST-Smad4融合蛋白。以人表皮HaCaT细胞的cDNA为模板,利用PCR扩增含有BamH I和SalI酶切位点的Smad4基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-Smad4融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。结果显示,成功构建pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Smad4蛋白;经MagneGST particles纯化的GST-Smad4蛋白可被Smad4的抗体特异识别。纯化的GST-Smad4蛋白可用于后续的生物学研究。 相似文献
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一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析 总被引:6,自引:0,他引:6
用接头PCR技术克隆了长度为1415 bp的PNZIP基因启动子, 该启动子具有真核生物启动子的典型特征, 引物延伸实验证明转录起始位点位于翻译起始位点上游122 bp处. 根据PNZIP基因启动子的序列特征, 利用PCR技术对该启动子进行了有目的的缺失, 将5个长度不同的启动子片段分别与报告基因GUS相连接, 构建植物表达载体, 转化烟草. 荧光定量检测结果表明: 5个不同长度的PNZIP启动子均能驱动GUS基因在光合组织中专一表达, 它们的活性随着启动子5′端的逐步缺失而不断地下降; 在叶片组织中长度为1415 bp的PNZIP启动子活性比35S启动子高9倍; PNZIP启动子中存在2个可能与光合组织特异表达有关的新的顺式作用元件, 即GAAATA和GATACT, GATACT元件可能决定基因的光合组织特异性表达, 而GAAATA可能作为增强子提高基因在光合组织的表达强度. 相似文献
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禽流感病毒NS1蛋白对细胞的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
NS1蛋白为流感病毒非结构蛋白,只在病毒侵入宿主细胞后产生.目前NS1蛋白对细胞整体水平上的作用仍不清楚,为了解NS1蛋白在病毒感染细胞中的作用,构建了重组质粒pCMV-myc-NS1并将其转染A549细胞,利用双向电泳技术检测了受NS1蛋白调控的宿主蛋白,以期从蛋白质组水平上研究禽流感病毒与宿主细胞间的相互作用.同时,还检测了转染NS1对细胞增殖和细胞周期的影响.结果显示,NS1在细胞中的表达,能够明显引起宿主细胞代谢的变化,并通过阻滞细胞周期的正常进行而减缓细胞的增殖. 相似文献
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牛蒡挥发油化学成分分析 总被引:4,自引:0,他引:4
用乙醚抽提牛蒡挥发油,运用GC-MS技术,结合计算机检索对其化学成分进行分析鉴定,用色谱峰面积归一化法计算各组分的相对含量。分离出68个组分,鉴定了其中63个组分,占总挥发油量的87.67%。牛蒡挥发油的主要成分为亚麻酸甲酯、亚油酸、三甲基-8-亚甲基-十氢化-2-萘甲醇、苯甲醛等。 相似文献
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旨在原核表达Pokemon基因的锌指结构域,纯化获得GST-Zinc finger的融合蛋白。以人胶质瘤T98G细胞的c DNA为模板,利用PCR扩增带有Bam H I和Sal I酶切位点的人Pokemon基因的锌指结构域,然后将其克隆到p GEX-4T-1原核表达载体中。将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化Zinc finger融合蛋白,最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。结果显示,成功构建p GEX-4T-1-Zinc finger原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Zinc finger蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Zinc finger蛋白可被识别Pokemon锌指结构域的抗体特异识别。纯化的GST-Zinc finger蛋白可用于后续的生物学研究。 相似文献
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根据GenBank中公布的人多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶10(PARP10)cDNA序列,设计并合成一对特异性引物,通过RT-PCR扩增293FT细胞mRNA,获得PARP10cDNA。将获得的cDNA克隆到pCMV-Myc和pEGFP-C1中,用免疫沉淀和激光共聚焦实验验证了PARP10和β-actin存在相互作用。然后,通过RT-PCR法发现该基因在小鼠体内表达的组织分布,组织表达谱显示该蛋白在各组织中均有表达;Westernblotting分析表明,UV造成的细胞损伤能够引起PARP10表达水平的增高。PARP10组织表达谱的确定,与β-actin相互作用的验证以及对UV的应激反应都为进一步研究PARP10的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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目的:合成并筛选有效抑制parp10表达的siRNA。方法:根据parp10 cDNA序列,设计并合成prap10基因潜在的RNA干扰(RNAi)片段,将合成的寡核苷酸序列构建到pEGFP-C1H1U6载体中;通过双萤光素酶试验、Western blotting筛选有效的干扰序列;进一步用G418对A549细胞进行耐受度筛选,确定最低耐受度;用G418溶液对转染RNAi重组质粒的A549细胞进行筛选,通过RT-PCR鉴定干扰效果。结果:针对617bp处所构建的RNAi载体能够抑制PARP10的表达,用浓度为400μg/mL G418的McCoy′s 5A培养基筛选转染后的细胞,获得了能够表达绿色荧光标签蛋白的A549细胞株,经RT-PCR检测发现,PARP10表达受到抑制。结论:获得了能够有效抑制PARP10表达的特异性小干扰RNA(siRNA),为进一步研究其生物学功能提供了条件。 相似文献
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