PES1慢病毒表达载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响

目的:利用慢病毒载体表达PES1基因,研究其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响.方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增PES1基因,克隆到pCDH载体,构建成pCDH-PES1,将其与包装载体共转293T细胞,包装成Lenti-PES1慢病毒载体并测定病毒滴度,感染乳腺癌ZR75-30细胞,Western印迹鉴定病毒载体...     

雌激素受体β共调节因子的研究进展

雌激素受体(ER)包括α和β等2种,均为核受体。ERβ在乳腺癌预后和激素治疗耐受中有重要意义,其活性受与之相互作用的共调节因子的影响。这些共调节因子有的能与2种ER发生作用,有的只能特异地作用于其中一种。本文简要综述了与ERβ相互作用的共调节因子的相关研究进展。     

Pescadillo抗体的制备及其表达研究

为深入研究Pescadillo的生物学功能及其在肿瘤发生过程中的潜在作用, 将该分子与GST融合表达, 融合蛋白经纯化、洗脱、免疫小鼠后获得其多克隆抗体, 运用抗体检测了Pescadillo分子的表达, 发现该分子的表达受雌激素的诱导; 该分子主要分布于乳腺、卵巢、小肠等细胞分裂旺盛的组织; 此外, 在人肾癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌以及不同的乳腺癌细胞株中均发现Pescadillo的表达; 通过比较乳腺癌患者癌组织与癌旁组织中Pescadillo的表达水平发现, 它在癌组织中的表达水平显著增加. 以上结果表明, Pescadillo可能在肿瘤的发生、发展中具有重要作用, 是肿瘤诊断与治疗的潜在靶标     

敲减人HPIP基因表达抑制细胞生长增殖

为了探讨人造血相关的PBX相互作用蛋白质基因（HPIP）在肿瘤发生发展中的生物学作用,构建了HPIP小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,验证其敲减效果并观察其对细胞生长增殖的影响.根据人HPIP的cDNA序列,设计了含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western 印迹分析检测HPIP基因的表达水平;结晶紫实验及流式细胞技术检测敲减HPIP基因表达对细胞生长和增殖的影响,软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响.结果显示,构建的siRNA能够有效抑制HPIP基因的表达;结晶紫实验与细胞周期分析实验显示,siRNA介导的HPIP表达沉默导致细胞生长增殖的显著抑制,软琼脂实验结果表明,稳定转染HPIP siRNA能够抑制肿瘤细胞的锚定非依赖性生长.上述结果初步表明,HPIP siRNA能明显抑制肿瘤细胞的生长与增殖,可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.     

肝癌细胞雌激素受体显性阴性突变体ERδ5基因的分离及生物学功能分析

临床流行病学研究显示,ERα基因第5外显子缺失突变体ERδ5在原发性肝细胞癌特异性高表达,它被认为是判断肝癌预后的最重要的新型分子标志.本研究从肝癌细胞分离雌激素受体突变体ERδ5基因,并对其进行克隆、表达,探讨其分子生物学特性及生物学功能. 通过反转录PCR,从肝细胞分离出ERδ5基因并将其克隆到真核表达载体,通过体外翻译及Western 印迹验证该基因成功表达;通过细胞荧光技术检测了ERδ5在肝细胞中的定位;利用荧光素酶报告基因检测技术确证ERδ5对ERα转录活性的影响.结果发现,从肝癌细胞分离出长1 113bp的ERδ5基因,该基因编码蛋白在体外不稳定,易于降解.在肝癌细胞中,ERδ5蛋白主要定位在细胞核,与ERα定位极为相似,但在生物学功能上,ERδ5能够明显干扰ERα的转录活性.研究结果表明,ERδ5作为显性阴性突变体,在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性.     

雌激素受体β真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体（ER）β的哺乳动物细胞表达载体,并检测其转录活性。方法：利用PCR扩增带有Flag标签的人类ERβ全长编码序列,将扩增片段克隆到哺乳动物细胞表达载体pIRESpuro2中,得到重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERβ;用Western blot鉴定Flag-ERβ重组蛋白在人胚肾293T细胞中的表达;用含雌激素应答元件（ERE）的报告基因系统检测Flag-ERβ的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERβ重组质粒,其介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含ERE的报告基因的表达。结论：ERβ高效真核表达载体的构建,为进一步研究ERβ在乳腺癌等疾病中的功能奠定了基础。     

PES1基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞的生长抑制

目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。     

pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

雌激素受体β转录激活系统的构建

目的：构建雌激素受体β（ERβ）的转录激活系统。方法：以pcDNA3-ERβ质粒为模板,利用PCR技术扩增ERβ全长及转录激活结构域1（AF1）、DNA结合结构域（DBD）、转录激活结构域2（AF2）等不同长度的基因片段,分别插入pGAL载体中,构建重组质粒,转染293T细胞,利用免疫杂交方法鉴定其表达情况,用萤光素酶报告基因（Gal4-LUC）检测转录活性。结果：构建了ERβ全长及不同功能区片段编码基因的重组质粒,转染293T细胞后检测到相应蛋白的表达;在活性实验中,雌激素（E2）诱导下pGAL-ERβ使Gal4-LUC活性升高约17倍,pGAL-ERβAF1在有无E2诱导下均能使Gal4-LUC活性升高2倍,pGAL-ERβAF2在E2诱导下使Gal4-LUC活性升高约7倍,pGAL-ERβDBD对Gal4-LUC活性没有明显作用。结论：ERβ的转录激活系统构建成功。