乙型肝炎病毒表面抗原aa126 Ile→Ser变异株HBsAg的暂时表达和抗原性鉴定

曾在一个儿童患者体内,发现一个新的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）变异株,其ＨＢｓＡｇ主蛋白ａａ１２６发生Ｉｌｅ（ＡＴＴ）到Ｓｅｒ（ＡＧＴ）的取代。已知ａｄｒ／ａｙｒ亚型ＨＢｓＡｇ１２６位为Ｉｌｅ,而ａｄｗ／ａｙｗ亚型ＨＢｓＡｇ１２６位为Ｔｈｒ,表明ＨＢｓＡｇ１２６Ｓｅｒ是一个新的变异株。用计算机做结构分析的结果表明,突变体ＨＢｓＡｇ１２６Ｓｅｒ主蛋白ａａ１２０－ａａ１３０区段的二级结构与野生型ａｄｒＨＢＶＨＢｓＡｇ１２６Ｉｌｅ相比发生明显的改变。这种构象的变化可能会影响ａ抗原决定簇（ａ１２４－ａａ１４７）的抗原性。为了证实这一点,构建了突变Ｓ基因表达质粒,在ＳＶ４０早期启动子的控制下进行抗原表达。利用ＨＢｓＡｇ９肽（Ｔｈｒ－Ｉｌｅ１２６－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ）抗ｉ单克隆抗体和９肽（Ｔｈｒ－Ｔｈｒ１２６－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ）抗ｔ单克隆抗体进行放射免疫测定,结果表明,这种Ｓｅｒ１２６突变蛋白对抗ｉ单克隆抗体的反应性比野生蛋白减弱,对抗ｔ单克隆抗体的反应性则与ＨＢｓＡｇ１２６Ｔｈｒ接近。但用三种抗－ａ单克隆抗体的检测结果揭示,突变蛋白ＨＢｓＡｇ１２６     

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建，表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术,将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→,Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９）,模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ）,以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性。突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上,经ＩＰＴＧ诱导,以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达,表达量占菌体总蛋白的１５～２０％。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５初步纯化该融合蛋白,然后用ＣＮＢｒ裂解,透析,冻干,反相ＨＰＬＣ纯化Ｃ端突变体Ｅｃｓ蛇毒蛋白,Ｎ端十个氨基酸分析与天然的相符,在ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈｐｌａｓｍａ）测活体系中,１０μｍｏｌ／Ｌ的ＡＤＰ诱导,Ｃ端突变体Ｅｃｓ抑制血小板凝聚的活性约为野生型４倍。得到了Ｅｃｓ的Ｃ端突变后使Ｅｃｓ抑制血小板凝聚的活性提高的结果。     

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建,表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术,将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→,Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９）,模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ）,以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性,突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上,经ＩＰＴＧ诱导,以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达,表达量占菌体总蛋白的１５￣２０％,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５初步纯化     

从织锦芋螺中克隆α芋螺毒素序列

为了从我国南海产织锦芋螺（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）中分离新的毒素序列并研究其应用价值,进行了织锦芋螺毒素基因的分离工作．从织锦芋螺毒管中提取ｍＲＮＡ,以Ａ族芋螺毒素的信号肽编码部分和３′端非翻译部分的保守序列为引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增和序列分析方法获得新的芋螺毒素序列．结果得到两种不同的α芋螺毒素序列,两者都属于α４／７亚型芋螺毒素,预测其成熟肽序列分别为Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ（Ｃ端Ｇｌｙ可能被酰胺化）和Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ．采用传统的生化分离手段尚未从织锦芋螺中获得过α芋螺毒素序列,这两种α芋螺毒素作用的种属特异性、受体类型特异性和在小细胞肺癌的诊断和治疗中的应用价值有待进一步研究     

大肠杆菌中一种对NF-IL63′UTR专一的结合蛋白

在大肠杆菌ＴＧ１ 中, 发现了一种与人白介素６ 核转录因子ｍＲＮＡ 的３′非翻译区专一结合的蛋白, 其Ｎ端氨基酸序列为ＡｌａＴｈｒＡｒｇＩｌｅＧｌｕＰｈｅＨｉｓＧｌｙＣｙｓｓ（ ？）Ｇｌｙ。对数据库检索未发现完全同源的蛋白。对于在大肠杆菌中发现真核ｍ ＲＮＡ专一结合蛋白的意义做了讨论。     

突变的叶绿体ATP合成酶ε亚基对菠菜叶绿体毫秒延迟发光的影响

突变和野生型体ＡＴＰ合成酶的ε亚基均可增强中绿体毫秒延迟发光的快相;不同的突变体对快相的增强强度不同,但与它们对离体ＣＦ１的Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶水解活力的抑制程度情况一致。且这种影响在１℃左右的低温下较显著,而温度升至２５℃时,这种增强作用趋于消失。加入解联剂后快相部分消除,ε亚基仍有增强作用。这些结果说明,ε亚基是通过与ＣＦ１的专一作用而影响光系统Ⅱ附近类囊体的动态结构,使质子不易从类囊体膜上流     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys378和381的点突变研究

用点突变的方法将大肠杆菌精氨酰—ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因ａｒｇｓ上相应于Ｌｙｓ３７８和Ｌｙｓ３８１的密码ＡＡＡ分别变为两氨酸的密码ＧＣＡ和精氨酸的密码子ＣＧＴ,得到了４个ａｒｇｓ的突变体ａｒｇｓ３７８ＫＡ,ａｒｇｓ３７８ＫＲ,ａｒｇｓ３８１ＫＡ和ａｒｇｓ３８１ＫＲ,将它们分别连接到ｐＵＣ１８上,转入大肠杆菌ＴＧ１,在ＴＧ１转化子中,ＡｒｇＲＳ及其变种的表达量约为ＴＧ１中的１２０倍以上。结果表明Ｌｙｓ３７８为Ａｒｇ和Ａｌａ取代分别使活力下降０％和１０％;Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ和Ａｒｇ后,活力分别下降３３％和１０％左右。Ｌｙｓ３７８不为酶活力必需。Ｌｙｓ３８１部位的正电荷对酶活力是重要的。     

突变的叶绿体ATP合成酶ε亚基对菠菜叶绿体毫秒延迟发光的影响

突变和野生型叶绿体ＡＴＰ 合成酶的ε亚基均可增强叶绿体毫秒延迟发光的快相;不同的突变体对快相的增强强度不同,但与它们对离体ＣＦ１ 的Ｃａ２＋ＡＴＰ酶水解活力的抑制程度情况一致。且这种影响在１ ℃左右的低温下较显著,而温度升至２５ ℃时,这种增强作用趋于消失。加入解联剂后,快相部分消除,ε亚基仍有增强作用。这些结果说明,ε亚基是通过与ＣＦ１ 的专一作用而影响光系统Ⅱ附近类囊体膜的动态结构, 使质子不易从类囊体膜上流失,质子动力势较难被解联剂所去除     

一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS的分离、纯化和性质

通过硫酸铵分级沉淀、ＣＭ－５２阳离子交换层析、ＨＲＬＣ分子排阻层析及ＦＰＬＣＭｏｎｏＳ离子交换层析等步骤,从丝瓜籽中分离到一组分子量为８ｋＤ左右的小分子核糖体失活蛋白——ＬｕｆｉｎＳ１、ＬｕｆｉｎＳ２、ＬｕｆｉｎＳ３。末端分析结果表明,它们的Ｎ端氨基酸分别为Ａｌａ、Ｐｒｏ和Ｔｈｒ。氨基酸序列分析确定了ＬｕｆｉｎＳ２的Ｎ端９个氨基酸的序列是Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ。ＬｕｆｉｎＳｓ对核糖体的失活机制与天花粉蛋白（ＴＣＳ）一致,是ＲＮＡＮ－糖苷酶催化型的。它们对无细胞蛋白质生物合成的抑制活性较ＴＣＳ略强,ＩＣ５０分别为１．３×１０－１１、１．０×１０－１０和６．３×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ左右。因此ＬｕｆｉｎＳｓ有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。     

凤眼莲根分泌物氨基酸组分对根际肠杆菌属F_2细菌的趋化作用

凤眼莲（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｃｒａｓｓｉｐｅｓ）的根分泌物中含有Ｍｅｔ等多种氨基酸,其中Ｍｅｔ、ＧＡＢＡ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ和Ｌｅｕ（１０－７～１０－２ｍｏｌ·Ｌ－１）均对凤眼莲的根际肠杆菌属Ｆ２（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．Ｆ２）细菌有强烈的正趋化作用;Ｇｌｕ、Ｔｈｒ和Ｈｉｓ（１０－７～１０－３ｍｏｌ·Ｌ－１）也对该菌有一定的正趋化作用;而Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ和Ｔｙｐ则对该菌表现出一定的负趋化作用．对细菌的正趋化作用存在一个趋化物的最适浓度范围．具有正趋化作用的氨基酸在凤眼莲根际的浓度都较高,而具有负趋化作用的浓度则较低,这正是凤眼莲与该根际细菌结合为根际微生态系统的原因之一．     

青霉素G酰化酶基因Ser177的定点突变

本研究用缺口以链法对肠杆菌青霉素Ｇ酰化酶（ＰＧＡ）基因Ｓｅｒ１７７进行寡核苷酸定点突变。通过ＮＩＰＡＢ（２－硝基－５－苯乙酰胺苯甲酸）试纸法筛选和测序鉴定,获得突变体Ｃｙｓ１７７,Ｇｌｙ１７７,Ａｒｇ１７７和Ａｓｎ１７７。它们的ＰＧＡ活性均已丧失。酶蛋白电泳分析表明突变体蛋白在体内正常表达。推测ＰＧＡ Ｓｅｒ１７７秀可能位于酶底物结合中心,是酶活性所必需,不能被置换。     

乙型肝炎病毒表面抗原aa126Il3→Ser变异株HBsAg的暂时表达和抗原性鉴定

曾在一个儿童患体内,发现一个新的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）变异株,其ＨＢｓＡｇ主蛋白ａａ１２６发生Ｉｌｅ（ＡＴＴ）到Ｓｅｒ（ＡＧＴ）的取代。已知ａｄｒ／ａｙｒ亚型ＨＢｓＡｇ１２６位为Ｉｌｅ,而ａｄｗ／ａｙｗ亚型ＨＢｓＡｇ１２６位为Ｔｈｒ,表明ＨＢＳａＧ１２６Ｓｅｒ是一个新的变异株。用计算机做结构分析的结果表明,突变体ＨＢｓＡｇ１２６Ｓｅｒ主蛋白ａａ１２０－ａａ１３０区段的二级结构与野生型ａｄｒ ＨＢ     

人白细胞介素－2第20位残基局部空间结构稳定位对活性的影响

用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素－２（ＩＬ－２）第２０位Ａｓｐ分别突变为Ａｒｇ、Ｌｙｓ．和Ａｓｎ,比较第２０位残基碱性基因对ＩＬ－２活力的影响,结果２０Ａｓｐ突变为碱性残基时,ＩＬ－２活性急剧下降,但突变为Ａｒｇ时所导致的活性下降较突变为Ｌｙｓ严重３０００倍以上,从空间结构变化上对这２个碱性残基造成的如此大的活性差异进行了分析,发现２０Ａｒｇ突变后对。１２１Ｔｒｐ的微环境有极为显著的影响。结果提示２０Ａｓｐ在与β亚基作用的同时,其局部空间结构的稳定对维持ＩＬ－２的生物学活性也有重要作用。     

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β转角的功能,利用基因突变技术,将该转角的氨基酸残基（Ｌｅｕ２０Ｇｌｙ２１Ｔｈｅ２２Ｐｒｏ２３Ｐｒｏ２４Ｇｌｎ２５）改为（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＧｌｙＧｌｎ２５）、（Ｌｅｕ２０ＳｅｒＧｌｙＧｌｎ２５）或（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＳｅｒＧｌｎ２５）,得到３个突变牛凝乳酶原表达质粒ｐＭＣＧＧ,ｐＭＣＳＧ和ｐＭＣＧＳ。除ｐＭＣＧＳ不能在大肠杆菌中表达外,ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ均能以包含体的形式进行表达,且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样,ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ的表达产物经过变性复性,均能自活化为假凝乳酶,而且复性后的酶原突变体在ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ上的柱行为与野生型相类似,但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小,但对酶的催化效率影响较大。     

白细胞介素－2分子α螺旋B中的活性相关区域

根据人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ａ螺旋Ｂ中氨基酸残基的空间分布选择性地突变了一些氨基酸残基,结果发现．５７Ｇｌｎ→Ｇｌｎ,６２Ｇｌｎ→Ｌｅｕ,６２Ｇｌｎ→Ａｒｇ和６５Ｐｒｏ→Ａｒｇ这些替换均使ＩＬ－２活性显著降低或丧失,而６３Ｌｅｕ→Ｓｅｒ或６４Ｌｙｓ→Ａｌａ对ＩＬ－２活性影响不大。从受体竞争抑制结合实验结果可知,上述不表现活性的突变体也同时丧失了与高亲和力受体的结合能力,这说明α螺旋Ｂ中这些位点对ＩＬ－２与受体结合有贡献,事实上,那些直接与受体β、γ亚基结合的残基所在螺旋为Ａ、Ｄ螺旋而非α螺旋Ｂ,由此我们认为α螺旋Ｂ虽不直接参与与受体β、γ亚基结合,但它在空间结构上对ＩＬ－２与受体β、γ亚基的结合产生了有利的影响,而５７Ｇｌｎ、６２Ｇｌｎ、６５Ｐｒｏ等残基则在此过程中发挥重要作用。     

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采用脱氨再生几丁质凝胶亲和层析从萝卜叶中获得了ＰＡＧＥ圆盘电泳均一的溶菌酶,并通过微量蒸发扩散法获得其结晶。用ｐＨ动力学研究方法和化学修饰法对该酶的活性中心进行了初步研究,实验结果表明：－ＣＯＯＨ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）基团、Ｔｒｐ及Ｈｉｓ残基可能为酶活性所必需。采用对Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基专一的修饰剂对酶作用后,酶活性基本上不受影响。同时,酶活性受到组胺和ＧｌｃＮＡｃ抑制。讨论了萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶的活性中心的相互差异。     

一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ,将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳＢ－ＴＮＦ－Ｋ２,并在大肠杆菌中进行表达。突变体［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α的表达产率达到菌体内总蛋白质的６０％以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型ｈＴＮＦ－α相比,［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性．     

转绿型白化突变系W25转绿过程中幼苗叶片内碳水化合物和氨基…

水稻转绿型白化突变系Ｗ２５与亲本２１７７ｓ苗期叶片内碳水化合物总量及蛋白质含量差异明显。亲本２１７７ｓ幼苗叶片内碳水化合物和蛋白质代谢在两种温度下基本稳定。但Ｗ２５却有明显不同,２５℃下Ｗ２５叶片内蔗糖和淀粉的含量比２０℃下的低,但还原糖含量明显地高,蛋白质含量较高,丙酮酸激酶和谷氨酰胺合成酶活性强,游离氨基酸中Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ的含量明显较低,Ａｒｇ,Ｐｒｏ,Ｔｈｒ含量明显较高,尤其是Ｔｈｒ     

大肠杆菌中一种对NF—IL63‘UTR专一的结合蛋白

在大肠杆菌ＴＧ１中,发现了一种与人白介素６核转录因子ｍＲＮＡ的３’非翻译区专一结合的蛋白,其Ｎ－端氨基酸序列为Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｉｌｕ－Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓｓ（？）－Ｇｌｙ。对数据库检索未发现完全同源的蛋白。对于在大肠杆菌中发现真核ｍＲＮＡ专一结合蛋白的意义做了讨论。     

胰蛋白酶分子中二硫键Cys129－Cys232的定位改造研究

对胰蛋白酶所特有的二硫键［１２９,２３２］进行了定位改造,将Ｃｙｓ突变为Ｓｅｒ,以观察其对胰蛋白酶稳定性及活性的影响。采用蛋白质工程的方法,构建了三个突变体Ｃ１２９Ｓ、Ｃ２３２Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ．在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌体中进行表达,表达产物用含胰蛋白酶特异性底物ＴＡＭＥ的活性胶检测活性,发现Ｃ２３２Ｓ丧失胰蛋白酶活性,而Ｃ１２９Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ保留了胰蛋白酶活性。在盐酸胍作用下比较双突变体和野生型胰蛋白酶活性,发现突变体Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ的稳定性有所降低。结果表明二硫键Ｃｙｓ１２９－Ｃｙｓ２３２对于胰蛋白酶的活性是非必需的,可能在稳定蛋白质的结构上发挥着重要作用。