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以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3—21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线.硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库。用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式筛选高产突变株。从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C。连续传代10次,产酸水平不变。在5L发酵罐中补料分批发酵72h,Ⅵ-10-C产琥珀酸87.6g/L,生产强度1.22g/(L·h),糖酸转化率0.66g/g;琥珀酸产量比出发菌提高了30%。代谢通量与关键酶活性分析表明:相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28.9%,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)酶活提高了23.5%。结果表明用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株。 相似文献
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利用携带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的pCI载体,实现tPA突变体(FrGGI)在CHO-dhfr^-细胞中的高效表达,获得高表达细胞株。采用分子克隆常规技术,将去除3’端非蛋白编码区的tPA突变体cDNA与pCI载体连接,构建真核表达载体pCI—tPA;采用阳离子脂质体转染法转染CHO-dhfr^-胞。经酶切及测序鉴定,证明所构建的质粒正确,转染CHO—dhfr细胞后,经过MTX加压筛选,得到了10株表达水平较高的细胞株,其活性可达每106细胞4000U/24h。以上结果为进行tPA突变体工程细胞株的筛选奠定了基础。 相似文献
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织锦芋螺ο家族芋螺毒素的序列分析 总被引:5,自引:0,他引:5
为了从织锦芋螺(Conustextile)中尽可能多地分离出ο家族的毒素序列和研究其应用价值,在克隆了织锦芋螺α芋螺毒素的基础上进行了织锦芋螺ο家族芋螺毒素基因的分离工作.从织锦芋螺毒管中提取m RNA,通过RACE(rapid am plification ofcDNA ends,cDNA 末端的快速扩增)-PCR方法扩增获得ο家族芋螺毒素cDNA 片段,并进行克隆和序列分析.从织锦芋螺毒液中获得了6种新的芋螺毒素序列,且毒素序列的成熟肽部分均符合C- C- CC- C- C的保守半胱氨酸框架.这些是新的ο家族芋螺毒素序列,新序列的阐明为进一步研究其生物活性和应用打下了基础. 相似文献
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目的:构建重组DTA—hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法:通过PCR扩增,获得只含白喉毒素(DT)活性部位(DTA)的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS—PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS—PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA—hS-20融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23%,表达形式主要为包涵体。结论:构建了DTA—hS-20重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。 相似文献
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目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。 相似文献
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目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。 相似文献
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目的:用建立的稳定表达脆性组氨酸三联体(Fhit)突变体的细胞株,研究 Fhit 与复制蛋白 A(RPA)之间的相互作用对细胞在 DNA 损伤后的影响.方法:用电离辐射或 DNA 损伤诱导剂喜树碱处理稳定表达 Fhit 突变体的阳性细胞株 HeLa-FhitA/D/F 后,通过流式细胞技术、MTT 比色法及克隆形成实验,检测这些细胞系的细胞周期变化情况以及对 DNA 损伤诱导剂的敏感性.结果:DNA 损伤诱导剂处理后,Fhit 突变体基的高表达可以使细胞表现出更强的G2期阻滞及对 DNA 损伤诱导剂更耐受.结论:Fhit 与 RPA 相互作用的改变影响了细胞对 DNA 损伤诱导剂的耐受性,为阐明 Fhit 在维持基组完整性方面的机理提供了线索. 相似文献
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重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂的冻干及活性贮存时间估计 总被引:1,自引:1,他引:0
研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂 ( u- PA)的冻干工艺 ,并对冻干产品的稳定性进行了观察。产品放置在 - 70℃和 4℃一年 ,活性和纯度未见明显变化。同时 ,通过在 80℃、70℃和 60℃的加速贮存试验 ( MIS) ,观察了 u- PA冻干产品的热稳定性 ,并对其活性的热降解速度和贮存寿命进行了估算。结果在 37℃、2 5℃、4℃和 0℃贮存时 ,活性单位损失 5 0 %所需时间分别为 1 73天、2 .78年、70 .8年和 1 1 8年 ;活性损失 1 0 %所需时间分别为 2 0天、1 0 0天、7.6年和 1 1年。说明 u- PA经冷冻干燥后保存 ,活性和纯度是稳定的 相似文献
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