人白细胞介素—2第20位残基局部空间结构稳定性对活性的影响

用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素－２（ＩＬ－２）第２０位Ａｓｐ分别突变为Ａｒｇ,Ｌｙｓ和Ａｓｎ,比较第２０位残基碱性基团对ＩＬ－２活力的影响,结果＾２０Ａｓｐ突变为碱性残基时,ＩＬ－２活性急剧下降,但突变为Ａｒｇ时所导致的活性下降较突变为Ｌｙｓ时所导致的活性下降较突变为Ｌｙｓ严重３０００倍以上。从空间结构变化上对这２个碱性残基造成的如此大的活性差异进行了分析,发现＾２０Ａｒｇ突变后对     

白细胞介素－2第17和20位残基在结构功能中的重要性研究

用基因定位突变法,将白细胞介素－２（ＩＬ－２）分子中１７Ｌｅｕ和２０Ａｓｐ进行一系列突变,并测定各突变体生物活性与空间结构的变化。分析结果表明１７Ｌｅｕ突变为Ａｓｐ时,ＩＬ－２的空间结构无明显变化。生物活性却显著下降;２０Ａｓｐ突变为Ｌｅｕ,以及１７Ｌｅｕ与２０Ａｓｐ对调后,均导致ＩＬ－２的空间结构发生变化,并严重影响其生物活性。上述结果说明１７Ｌｅｕ突变为Ａｓｐ后对活性的影响并非由空间结构变化所引起,而与残基本身性质有关：１７Ｌｅｕ与２０Ａｓｐ这两个重要的残基,必须位于各自特定的空间位置,才能发挥其生物作用。     

白细胞介素—2第17和20位残基在结构功能中的重要性研究

用基因定位突变法,将白细胞介素－２分子中１７Ｌｅｕ和２０Ａｓｐ进行一系列突变,并测定各突变体生物活性与空间结构的变化。分析结果表明１７Ｌｅｕ突变为Ａｓｐ时,ＩＬ－２的空间结构无明显变化,生物活性却显著下降;２０Ａｓｐ突变的为Ｌｅｕ,以及１７Ｌｅｕ与２０Ａｓｐ对调后,均导致ＩＬ－２的空间结构发生变化,并严重影响其生物活性,上述结果说明１７Ｌｅｕ突变为Ａｓｐ后对活性的影响并非由空间结构变化所引起,而与     

白细胞介素—2分子α螺旋B中的活性相关区域

根据人白细胞介素－２（ＩＬ－２）α螺旋Ｂ中氨基酸残基的空间分布选择性地突变了一些氨基酸残基,结果发现：５７Ｇｌｎ→Ｇｌｕ,６２Ｇｌｕ→Ｌｅｕ,６２Ｇｌｕ→Ａｒｇ和６５Ｐｒｏ→Ａｒｇ这些替换均使ＩＬ－２活性显著降低或丧失,而６３Ｌｅｕ→Ｓｅｒ或６４Ｌｙｓ→Ａｌａ对ＩＬ－２活性影响不大。从受体竞争抑制结合实验结果可知,上述不表现活性的突变体也同时丧夫了与高亲和力受体的结合能力,这说明α螺旋Ｂ中这些位点     

白细胞介素－2分子α螺旋B中的活性相关区域

根据人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ａ螺旋Ｂ中氨基酸残基的空间分布选择性地突变了一些氨基酸残基,结果发现．５７Ｇｌｎ→Ｇｌｎ,６２Ｇｌｎ→Ｌｅｕ,６２Ｇｌｎ→Ａｒｇ和６５Ｐｒｏ→Ａｒｇ这些替换均使ＩＬ－２活性显著降低或丧失,而６３Ｌｅｕ→Ｓｅｒ或６４Ｌｙｓ→Ａｌａ对ＩＬ－２活性影响不大。从受体竞争抑制结合实验结果可知,上述不表现活性的突变体也同时丧失了与高亲和力受体的结合能力,这说明α螺旋Ｂ中这些位点对ＩＬ－２与受体结合有贡献,事实上,那些直接与受体β、γ亚基结合的残基所在螺旋为Ａ、Ｄ螺旋而非α螺旋Ｂ,由此我们认为α螺旋Ｂ虽不直接参与与受体β、γ亚基结合,但它在空间结构上对ＩＬ－２与受体β、γ亚基的结合产生了有利的影响,而５７Ｇｌｎ、６２Ｇｌｎ、６５Ｐｒｏ等残基则在此过程中发挥重要作用。     

IL—2部分拮抗剂可用于IL—2突变体对受体亚基结合能…

用定点突变法分别得到了两个人白细胞介素－２（ＩＬ－２）的部分拮抗剂１５Ｖａｌ－ＩＬ－２和１２６Ａｓｐ－ＩＬ－２以及一个为ＩＬ－２受体ａ亚基结合缺陷型的突变体６２Ｌｅｕ－ＩＬ－２,当将１５Ｖａｌ－ＩＬ－２或１２６Ａｓｐ－ＩＬ－２与６２Ｌｅｕ－Ｉｌ－２共同保温时,６２Ｌｅｕ－ＩＬ－２的活性受到明显抑制,对此现象机理的分析表明１５Ｖａｌ－ＩＬ－２或１２６Ａｓｐ－ＩＬ－２可用于ＩＬ－２受体亚基结合缺陷型突     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子;得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量至少为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１、转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ、ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＲ分别为１．６５、２１０、１．８和３８单位／毫克。结果表明ＡｒｓＲＳ的Ｌｙｓ３０６为Ａｌａ取代使活力完全丧失;若被Ａｒｇ取代,则活力丧失８０％以上。Ｌｙｓ３０６为ＡｒｇＲＳ活力所必需。     

蛇毒锯鳞蝰素基因Leu14—Lys15—Glu16的定点突变

本研究的目是的利用蛋白质工程定点突变的方法,在蛇毒锯鳞蝰素基因分子上增加另一个保守序列ＲＧＤ（１４位精氨酸残基,１５位甘氨酸残基,１６位天氨酸残基）,以其增加该分子的生物活性,并探讨蛋白质一级结构,空间结构和功能的关系,在质粒ｐＪＣ６４的基础上,利用ＰＣＲ定点突变方法,对蛇毒锯鳞蝰素基因Ｌｅｕ１４－Ｌｙｓ１５－Ｇｌｕ１６进行定点突变,使相应的ＰＣＲ定点突变方法,对蛇毒锯鳞蝰素基因Ｌｅｕ１４－Ｌｙｓ     

蛇毒锯鳞蝰素基因Leul4－Lys15－Glu16的定点突变

本研究的目的是利用蛋白质工程定点突变的方法,在蛇毒锯鳞蝰素基因分子上增加另一个保守序列ＲＧＤ（１４位精氨酸残基,１５位甘氨酸残基,１６位天冬氨酸残基）,以其增加该分子的生物活性,并探讨蛋白质一级结构,空间结构和功能的关系。在质粒ｐＪＣ２６４的基础上,利用ＰＣＲ定点突变方法,对蛇毒锯鳞蝰素基因Ｌｅｕ１４－Ｌｙｓ１５－Ｇｌｕ１６进行定点突变,使相应的ＤＮＡ片段变成表达Ａｒｇ１４－Ｇｌｙ１５－Ａｓｐ１６的核苷酸顺序,经酶切和ＤＮＡ测序鉴定正确。ＣＮＢｒ裂解后,用反相ＨＰＬＣ分析,分离制备突变体蛇毒锯鳞蝰素,制备的突变体蛇毒锯鳞蝰素的Ｎ－末端１０个氨基酸残基与天然蛇毒锯鳞蝰素的相同。在人的富含血小板血浆测活体系中,经１０μｍｏｌ／Ｌ的ＡＤＰ诱导,突变体蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ５０为３．０×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ;重组野生型蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ５０为４．０×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ;天然蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ_（５０）为２．８×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ。此外,就蛇毒锯鳞蝰素中保守序列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ以及其空间构象对蛇毒锯鳞蝰素抑制血小板凝集之间的关系进行了讨论。     

重组水蛭素的突变及突变体部分性质研究

以基因突变结合动力学分析的方法研究了水蛭素空间结构及其与凝血酶的相互作用．采用基因定点突变和随机突变的方法得到两个重组水蛭素突变体,并从抗酰胺水解活性,抗凝血酶活力和稳定性三个方面,比较研究了重组水蛭素ｒＨＶ２中４７位和１１位两个氨基酸残基对其稳定性和抑制能力的影响．将ｒＨＶ２中Ｇｌｎ１１和Ａｓｎ４７分别突变为Ｈｉｓ１１和Ｌｙｓ４７后,ｒＨＶ２－Ｈ１１生物活力降低３０％,ｒＨＶ２－Ｋ４７生物活力提高６１％．测定抑制常数Ｋｉ表明,ｒＨＶ２－Ｈ１１突变体Ｋｉ值升高１４倍,ｒＨＶ２－Ｋ４７突变体Ｋｉ值降低１４倍,两个突变体的热稳定性均有所增强,ｒＨＶ２－Ｈ１１在酸性和碱性条件的稳定性降低．分析实验结果,可以认为：①４７位的Ｌｙｓ可能是通过氢键和静电两种作用力同时影响着水蛭素的三维结构和其与凝血酶的结合．②１１位氨基酸可能是水蛭素分子中另一个重要位点．     

虎纹捕鸟蛛毒素-I单残基突变体R20A-HWTX-I的化学合成与性质分析

虎纹捕鸟蛛毒素－１（Ｈｕｗｅｔｏｘｉｎ－１,ＨＷＴＸ－１）是从虎纹捕乌蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａ ｈｕｗｅｎａ）的粗只同的一种多肽类神经毒素。为了探明该毒素分子中统一的Ａｒｇ残基与其生物学活性的关系,运用固相多肽合成技术和Ｆｍｏｃ化学直接构建了Ａｌａ取代ＨＷＴＸ－１第２０位Ａｒｇ（Ｒ２０）的突变体Ｒ２０Ａ－ＨＷＴＸ－１;将合成的突一置于含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化复性后用反相和特殊设计的离子交换Ｈ     

白细胞介素－2中某些残基替换对活性的影响

用基因定点突变法研究了白细胞介素－２（ＩＬ－２）中某些氨基酸对生物活性的影响。将ＩＬ－２中３９Ｍｅｔ和４３Ｌｙｓ分别改为Ｐｒｏ,企图破坏此处α螺旋,突变体的ＣＤ图谱和生物活性均,不变,说明此处可能原来就不存在α螺旋．而将５２Ｇｌｕ．５３Ｌｅｕ,５４Ｌｙｓ分别改为Ｐｒｏ后,ＣＤ谱发生了变化,生物活性也显著下降。表明这些氨基酸处在α螺旋中,将它们改为Ｐｒｏ后,影响了ＩＬ－２的结构,并导致活性下降     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys378和381的点突变研究

用点突变的方法将大肠杆菌精氨酰—ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因ａｒｇｓ上相应于Ｌｙｓ３７８和Ｌｙｓ３８１的密码ＡＡＡ分别变为两氨酸的密码ＧＣＡ和精氨酸的密码子ＣＧＴ,得到了４个ａｒｇｓ的突变体ａｒｇｓ３７８ＫＡ,ａｒｇｓ３７８ＫＲ,ａｒｇｓ３８１ＫＡ和ａｒｇｓ３８１ＫＲ,将它们分别连接到ｐＵＣ１８上,转入大肠杆菌ＴＧ１,在ＴＧ１转化子中,ＡｒｇＲＳ及其变种的表达量约为ＴＧ１中的１２０倍以上。结果表明Ｌｙｓ３７８为Ａｒｇ和Ａｌａ取代分别使活力下降０％和１０％;Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ和Ａｒｇ后,活力分别下降３３％和１０％左右。Ｌｙｓ３７８不为酶活力必需。Ｌｙｓ３８１部位的正电荷对酶活力是重要的。     

人白细胞介素－2的两个部分拮抗剂

通过定点诱变技术得到６个生物活性剧烈下降的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）突变体,其中两个突变体即１５Ｖａｌ－ＩＬ－２和１２６Ａｓｐ－ＩＬ－２可以在一定浓度范围内使ＩＬ－２的生物效应降低。在对高亲和力ＩＬ－２受体（ＩＬ－２Ｒ）的竞争抑制实验中,１５Ｖａｌ－ＩＬ－２和１２６Ａｓｐ－Ｉｌ－２又表现了一定的竞争能力。这些结果表明１５Ｖａｌ－ＩＬ－２和１２６Ａｓｐ－ＩＬ－２可部分拮抗天然ＩＬ－２的作用。结合Ｉ     

白细胞介素－2镇痛功能位点的研究

白细胞介－２（ＩＬ－２）是重要的免疫调节因子,近来发现还有中枢镇痛作用,用不同ＩＬ－２突变体测定其对大鼠痛阈的影响,发现完全丧失免疫刺激作用的２０Ｌｅｕ－ＩＬ－２（２０Ａｓｐ→Ｌｅｕ）仍能显著提高大鼠的痛阈,其作用强度与天然ＩＬ－２无显著差异,而另一突变体４５Ｖａｌ－ＩＬ－２（４５Ｔｙｒ→Ｖａｌ）虽保留免疫学活性却不能提高大鼠的痛阈;这些结果证明ＩＬ－２分子中具有镇痛作用与具有免疫作用与具有免疫作     

一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ,将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳＢ－ＴＮＦ－Ｋ２,并在大肠杆菌中进行表达。突变体［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α的表达产率达到菌体内总蛋白质的６０％以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型ｈＴＮＦ－α相比,［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性．     

酵母转录调控因子PH081的结构与功能

本文发现ＰＨＯ８１蛋白上的碱性区（８８－１６０）和酸性区（７７１－８１０）附近的微小变化可导致ｒＡＰａｓｅ的表达向组成型转化,且这两个区域是协同作用的,而酸性区的净负电荷的降低能使ｒＡＰａｓｅ的活力降低。ＰＨＯ８１蛋白中有６个锚蛋白重复单位（ａｎｋｙｒｉｎｒｅｐｅａｔｓ）,是ＰＨＯ８１蛋白与ＰＨＯ８０－ＰＨＯ８５蛋白复合物的结合区。对锚蛋白重复序列的突变表明锚蛋白重复序序列１,２,４,５,６对ＰＨＯ８１是十分关键的,而锚蛋白重复序列３的Ｐｒｏ５０９,Ｌｅｕ５１０的缺失并不影响ＰＨＯ８１的功能。在ＰＨＯ８１蛋白的７０１－７１９位氨基酸残基有一段类似核定位序列的肽段,相应基因片段的缺失导致ＰＨ０８１完全失活。但将该可能的核定位序列的最保守的碱性氨基酸Ａｒｇ７０１、Ｌｙｓ７０２同时变为中性氨基酸（Ｓｅｒ,Ｇｉｎ）导致ｒＡＰａｓｅ的表达大大提高,而将核定位序列中Ｌｙｓ７１７变为Ａｓｎ,或将Ａｒｇ７１９变为Ｓｅｒ,都不影响ＰＨＯ８１的功能。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子,得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量生活为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１,转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇ     

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建,表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术,将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→,Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９）,模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ）,以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性,突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上,经ＩＰＴＧ诱导,以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达,表达量占菌体总蛋白的１５￣２０％,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５初步纯化     

尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2基因的克隆与序列分析

从尖吻蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,经ＲＴＰＣＲ扩增磷脂酶Ａ２的基因,以江浙蝮蛇的酸性磷脂酶Ａ２基因为探针杂交筛选克隆,分离得到４种磷脂酶Ａ２基因。经双向测序测定了这些磷脂酶Ａ２同功酶基因的全序列,并由此推导出编码的氨基酸序列。运用计算机软件推算了它们的等电点,按照等电点和结构特征将它们分别命名为尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２Ｉ（Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ）、尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２ＩＩ（Ａ．ａＡＰＬＡ２ＩＩ）、尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶Ａ２（Ａ．ａＢＰＬＡ２）和尖吻蝮蛇毒Ｌｙｓ４９磷脂酶Ａ２（Ａ．ａＬｙｓ４９ＰＬＡ２）。其中Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ的１～１０位氨基酸残基序列同以前分离得到的尖吻蝮蛇酸性磷脂酶Ａ２已测定的１～１０位氨基酸残基序列完全一致。Ａ．ａＬｙｓ４９ＰＬＡ２基因则由于其推导出的４９位氨基酸残基由Ｌｙｓ代替了Ａｓｐ而区别于以前克隆到的磷脂酶Ａ２基因。最后运用计算机软件比较了它们的同源性。这一组磷脂酶Ａ２基因的克隆,将为进一步研究磷脂酶Ａ２的结构与功能的关系提供更多的信息。