犬冠状病毒纤突蛋白基因的扩增与克隆

本研究根据Wesseling(1992)发表的K378株犬冠状病毒(CCV)纤突蛋白(S)基因序列,设计合成了2对寡聚核苷酸引物P_1(18 bp,1520～1537 bp)、P_2(19 bp,2072～2090 bp)和P_3(20 bp,2621～2640 bp)、P_4(20 bp,2944～2963 bp)。采用异硫氰酸胍法分别从美国参考株CCV NL-18和两个国内分离株CCV YS1、CCV CI1接种的CRFK细胞培养物中提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链后,     

用套式PCR方法检出腹泻及健康犬粪中的犬冠状病毒

自2003年夏至2004年初的8个月内收集犬粪样112份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪便43份,某养犬场群养健康犬粪便30份,沈阳地区某养犬基地群养健康犬粪便 39 份,用套式 PCR方法检测犬冠状病毒(CCV)。结果显示,南京家庭单养腹泻病犬 CCV阳性率为 40.9%(18/43),CCV检出率与季节相关,冬季的检出率较高。健康犬阳性率为84.1%(58/69),其中沈阳某场健康犬CCV的感染率(87.2%)高于南京某犬场(80.0%)。取南京腹泻犬和沈阳健康犬阳性样本各2份测序,结果表明,4个样本 M基因 212bp的序列与 GenBank登录的中国大熊猫源的CCV同源性最高(94.8~96.7),并且南京和沈阳CCV毒株之间存在一定序列差异。所有阳性样本用 CCV基因型鉴别PCR鉴定,均为CCVⅡ型。     

用套式PCR方法检出腹泻及健康犬粪中的犬冠状病毒

自2003年夏至2004年初的8个月内收集犬粪样112份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪便43份,某养犬场群养健康犬粪便30份,沈阳地区某养犬基地群养健康犬粪便39份,用套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV).结果显示,南京家庭单养腹泻病犬CCV阳性率为40.9%(18/43),CCV检出率与季节相关,冬季的检出率较高.健康犬阳性率为84.1%(58/69),其中沈阳某场健康犬CCV的感染率(87.2%)高于南京某犬场(80.0%).取南京腹泻犬和沈阳健康犬阳性样本各2份测序,结果表明,4个样本M基因212bp的序列与GenBank登录的中国大熊猫源的CCV同源性最高(94.8～96.7),并且南京和沈阳CCV毒株之间存在一定序列差异.所有阳性样本用CCV基因型鉴别PCR鉴定,均为CCVⅡ型.     

犬瘟热和犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的应用

塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟热(CDV)和犬冠状病毒(CCV)牧异性引物对同一样品中CDV和CCV的RNA模板进行联合RT—PCR扩增,并优化其扩增条件,得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明：该联合PCR能检测出10^-4倍稀释的CDV模板(10^6.6TCID50／0．1mL)。对7份临床发病犬病科检测,其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高度敏感、特异、准确、快速等特点,适用于当前民用和军用兽医临床对CDV、CCV的检测和对犬的其他疾病的鉴别诊断。     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株1-71的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析.结果表明,CCV1-71与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种.NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株.序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组"热点"区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似.CCV NJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV 79-1683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组.CCV M蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内.M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守.N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关.     

国内信息

犬瘟热和犬冠状病毒联合RT PCR检测方法的应用塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟热(CDV)和犬冠状病毒(CCV)牧异性引物对同一样品中CDV和CCV的RNA模板进行联合RT PCR扩增,并优化其扩增条件,得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明:该联合PCR能检测出104倍稀释的CDV模板(106.6TCID50/0.1mL)。对7份临床发病犬病科检测,其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高度敏感…     

从健康狐狸、貉粪中检出犬冠状病毒的两种基因型

取某养殖场健康狐狸 (6 1份 )、貉 (2 4份 )粪样 ,用套式PCR(RT-nPCR)方法检测犬冠状病毒 (CCV)并进行基因型鉴定。结果显示 :狐狸粪样中有 4 3份 (70 . 5 % )为CCVⅡ型阳性 ,2 9份 (47. 5 % )为CCVⅠ型阳性 ,两型混合感染2 5份 ,占 4 1 0 % ,两型总感染率为 77 .0 %。 2 4份貉粪样中 ,2 2份为CCVⅡ型阳性 (91 .7% ) ,其中 16份为CCVⅠ型、Ⅱ型混合感染 (6 6 . 7% )。分别取狐狸和貉粪样中CCVⅠ、Ⅱ型阳性PCR产物各 2份 (共 8份 )进行测序 ,均与CCV的M基因序列相符 ,证实PCR结果非假阳性。序列及系统进化分析表明 ,CCVⅠ型与源于意大利腹泻犬的CCVⅠ型 (AF5 0 2 5 83)同源性最高 (96 . 7%～ 98. 1% ) ;CCVⅠ、Ⅱ两种基因型同源性为 88. 3%～ 89. 7% ,在进化树中处于两个大的分支上 ;同为CCVⅡ型 ,狐狸源与貉源序列也存在多个位点差异。首次在貉粪中检出CCV ,证实在健康狐狸、貉群体中存在CCV流行 ,且CCVⅠ、Ⅱ型并存。     

犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVGP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVGP野毒株进行了RT—PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCV标准毒株Insavc—1N基因相比,核苷酸的同源性为92．6％,推导的氨基酸的同源性为93．2％。在推导的N蛋白N端156—179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc—1株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET8a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IFTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为48KD的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49．3％,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株171的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析。结果表明,CCV171与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种。NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株。序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组“热点”区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似。CCVNJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV791683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组。CCVM蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内。M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守。N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关。     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

圈养小熊猫几种病毒的PCR检测

本文采用巢式PCR/ RT-PCR 方法,对我国10 个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71 个肛拭子和61 个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁。对阳性PCR 结果进行测序分析,并与GenBank 上的序列进行比较。结果,在肛拭子样品中检测到3 个CPV 和6 个CCV 阳性结果,经测序后,与GenBank 上序列的同源性分别达99% 和100% 。而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV 的检测结果均为阴性。从阳性CPV 的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作。本文所采用的PCR 方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定.该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白.与GenBank中已发表的11个CCV毒株S基因相比,S基因核苷酸序列同源性在40.2%～99.5%之间;推导的氨基酸序列同源性在15.9%～99.0%之间.DXMV株S基因变异区主要集中在该基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区却十分保守.基于S全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和US patent株亲源关系最近.推导的DXMV株S蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的.另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究.     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichiapastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断.用特异性引物扩增出CCVDXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1.用KpnI和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZ αAS1.将pPICZαAS1用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子.用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测.结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应.凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右.用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达18-116,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性.     

大白菜病毒的圆二色性

曾从大白菜中纯化了烟草花叶病毒新株——大白菜病毒(CCV)。本文研究了它的圆二色性。它的近紫外圆二色(CD)谱在273nm显示一个大正峰,在273～300nm间有3个肩膀。近紫外CD谱形和TMV-HR株的相似。远紫外CD谱在221nm呈负峰,在208～209nm处有一个较弱的肩膀,197nm处有一强正峰。在pH5～10.8的范围里,CCV呈相同的CD谱。溶液中不同的盐浓度对CCV的CD谱没有明显影响。游离的CCV外壳蛋白质的CD谱呈双负峰,游离核酸的CD谱与一般RNA的CD谱相似。这些结果说明,CCV远紫外CD谱几乎完全由蛋白质组分贡献,近紫外CD谱可能说明病毒颗粒内RNA和蛋白质间有很强的相互作用。     

马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法

为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT FC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDVmeq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株s基因相比,s基因核苷酸序列同源性在40．2％-99．5％之间;推导的氨基酸序列同源性在15．9％-99．O％之间。DXMV株s基因变异区主要集中在该基因前1／2处,其中350．370、439．478、1718．1818三个区域碱基变异较大,而1060．1700区却十分保守。基于s全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株s蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc．1弱毒多一个;其中第566．568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。     

大白菜病毒的圆二色性

曾从大白菜中纯化了烟草花叶病毒新株——大白菜病毒(CCV)。本文研究了它的圆二色性。它的近紫外圆二色(CD)谱在273nm显示一个大正峰,在273～300nm间有3个肩膀。近紫外CD谱形和TMV-HR株的相似。远紫外CD谱在221nm呈负峰,在208～209nm处有一个较弱的肩膀,197nm处有一强正峰。在pH5～10.8的范围里,CCV呈相同的CD谱。溶液中不同的盐浓度对CCV的CD谱没有明显影响。游离的CCV外壳蛋白质的CD谱呈双负峰,游离核酸的CD谱与一般RNA的CD谱相似。这些结果说明,CCV远紫外CD谱几乎完全由蛋白质组分贡献,近紫外CD谱可能说明病毒颗粒内RNA和蛋白质间有很强的相互作用。     

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及初步应用

根据胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)apxIVA毒素基因序列和16SrRNA序列分别设计了一对特异性引物P1P4和一对通用引物S7S10,建立了检测App全部15个血清型的复合PCR方法。对App的15个血清型国际参考株和国内的11个App菌株进行检测,都能得到363bp和692bp的两个扩增片段。而放线杆菌等13株参考菌株只能得到692bp的扩增片段。该方法能将15个血清型的App菌株鉴定到种。检测的灵敏度达9pgDNA1300CFU。用建立的方法检测临床分离的302株可疑菌株,阳性4株,与其它鉴定方法相符。结果表明复合PCR可用于App菌株的鉴定。     

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒.提纯的病毒粒子经SDS-热酚法抽提,在使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9.SgRNA双链经高温变性,使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMD18-T载体上.利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段.序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框(ORF).推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa.和家蚕1型质型多角体病毒的I株(BmCPV-II strain)位于第九片段的NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86.0%和93.4%.     

随机扩增多态性DNA技术对结核分支杆菌菌株鉴别及其耐药相关性分析

用引物G1和L1扩增的16S-23SrDNA间隔区作为模板DNA,再用引物AP50进行随机扩增多态性DNA（Random Amplified PolymorphicDNA,RAPD)分棉线AP50扩增出的各菌株DNA片段,用1.2%的琼脂糖凝胶电泳EB染色,可获得1或2个大小不同的DNA片段（390-1031bp)。各株间差异明显,结果表明,不同菌株有不同的DNA多态性,药物敏感株与耐药株之间多态性差异明显,耐药株中耐药谱相似或相同的菌株间其多态性也相似,RAPD有助于简便,快速,有效地了解菌株间的克隆相关性及耐药性传播。