猴源细小病毒血凝和血凝抑制试验的优化与应用

目的优化猴源细小病毒的血凝和血凝抑制（HA/HI）试验条件,以优化的方法对160份2010年～2011年间采集于中国北京地区圈养猴群的血清样品进行猴源细小病毒抗体调查。方法 在不同的缓冲液、缓冲液pH值、猪红细胞浓度、兔血清浓度、阿氏液比例和温度下进行猴源细小病毒的HA/HI试验,选择合适的HA/HI条件。通过优化的HA/HI方法对160份猴血清进行猴源细小病毒抗体检测。结果pH 7.0、0.02 mol/L PBS、0.75%猪红细胞、0.5%兔血清和4℃可作为猴源细小病毒HA/HI试验合适的反应条件,猪血球以1∶1阿氏液抗凝,可保存5～7 d不影响实验结果。猴血清的猴源细小病毒抗体阳性率为58.1%。结论方法优化后稳定性增强、检测时间缩短、准确性提高。细小病毒在我国北京地区圈养猴群中感染比较普遍。     

核酸适配体及其在病原微生物学中的应用

核酸适配体指利用指数富集配体系统进化技术筛选出的寡聚核苷酸片段,它可以特异性地识别靶标并与之结合,已经广泛应用于基础研究、临床诊断、纳米技术等。以下综述了适配体在微生物学方面的应用。     

狂犬病病毒Evelyn- Rokitnicki-Abelseth疫苗株反向遗传系统的建立

摘要：【目的】建立狂犬病毒的反向遗传系统,为研制不含狂犬病病毒致病性的新型安全高效的狂犬疫苗提供技术依据。【方法】本研究采用反向遗传学方法和分子克隆技术,建立了狂犬病病毒Evelyn- Rokitnicki-Abelseth (ERA)疫苗株的CMV/ T7、T7启动子病毒拯救系统,构建了表达N、P、L蛋白的辅助质粒。【结果】成功拯救出野生型病毒rERA-VC,在Vero细胞上的生长动力学特性与父母本ERA 相同,第三代可在Vero细胞上可获得很高的生长滴度。【结论】建立了狂犬病病毒的反向遗传系统,拯救出的野生型病毒生物学特性与父母本相同。     

西方马脑炎核酸疫苗表达载体构建及免疫原性研究

为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性.采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显著(P＜ 0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16.研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础.     

虎源H5N1亚型高致病性禽流感病毒人工感染家猫的病理学研究

经SPF鸡胚增殖的虎源高致病性禽流感病毒A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)株,其对MDCK细胞的TCID50为10-7.36/0.05 mL,经气管接种途径人工感染家猫,对感染致死的家猫和对照组家猫心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器进行组织病理学观察和免疫组织化学染色,同时采集咽拭子和各脏器乳剂上清液进行RT-PCR检测,对耐过家猫与对照组家猫进行HI抗体测定。结果表明:剖检感染的死亡家猫以肺脏的损害最为明显,肺叶上有大片暗红色实变灶,呈多病灶融合性肺损伤。组织学光镜观察,病毒对家猫的损害主要见于肺脏,呈融合性炎性病变,浸润的主要为单核细胞,肺泡腔内可见较多量巨噬细胞浸润及少量蛋白样浆液渗出。免疫组织化学染色发现在支气管上皮细胞、少数肺泡上皮细胞和单核细胞胞浆中可见到该病毒的抗原阳性染色颗粒。RT-PCR检测结果在咽拭子以及肺、肾、心、脑组织中均扩出与理论值一致的464bp核酸条带,耐过家猫血清H5N1亚型流感病毒HI抗体效价为1∶32。     

熊猫等动物犬瘟热病毒附着蛋白基因的遗传多样性

为了研究犬瘟热病毒（ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ,ＣＤＶ）大熊猫株、小熊猫株和长春犬株附着蛋白（Ｈ）基因的遗传这异,对Ｈ基因进行了序列测定。上述３个ＣＤＶ毒株的Ｈ基因全长均为１９４６ｂｐ,开放阅读框架（ＯＲＦ）始于２１－２３位的ＡＴＧ,终止于１８４２－１８４４位的ＴＧＡ,编码６０７个氨基酸。与ＧｅｎＢａｎｋ中１５个ＣＤＶ株推导的Ｈ蛋白氨基酸序列比较发现,１６个野毒株潜在的Ｈ－联糖基     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

狂犬病病毒重组免疫毒素的表达及其生物活性鉴定

将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总蛋白的32.29％。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96％的目的蛋白,间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性,MTT试验显示,重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用,而对正常细胞无杀伤作用。     

虎血清H5 亚型流感病毒抗体调查

为查明我国圈养虎群中H5 亚型流感病毒的流行情况,应用血凝抑制(HI)方法检测了1998 ～ 2009 年间采集于哈尔滨、宜昌、桂林、唐山、上海和郑州等地的309 份虎血清样品的H5 亚型流感病毒抗体效价。结果发现1998 年4 月至2002 年4 月采集的20 份血清样品全部为H5 亚型流感病毒HI 抗体阴性。在2002 年7 月至2003
年6 月采样于上海、唐山、哈尔滨的34 只虎中,有31 只曾出现过高热、抽搐和肺炎症状,其中24 只虎的血清样品H5 亚型流感病毒HI 抗体呈阳性(抗体效价1∶ 10 ～ 1∶ 320),2 只无临床症状虎也为抗体阳性。对2004 年随机采集自哈尔滨的220 份血清样品调查发现抗体阳性率可达25.9% ,其中28 只有临床高热与肺炎病史的虎中有14 只抗体呈阳性(抗体效价1∶ 10 ～1∶ 80),其余无病史的192 只虎中有43 只抗体阳性。2009 年8 月采集的35 份血清中仅有3 份H5 阳性,抗体阳性率下降为8.6% 。上述结果表明H5 亚型流感病毒能够感染虎并对圈养虎的健康构成威胁,而且其公共卫生意义更值得关注。