诱导性多能干细胞研究技术的现状与前景

2006年Takahashi研究小组成功地将小鼠的胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞重编成为诱导性多能干细胞(iPSC),开创了体细胞重编程的全新方法,所得iPSC具有和胚胎干细胞相似的生物学特性,不仅解决了人类胚胎干细胞研究所面临的伦理学困境和免疫排斥问题,而且进一步深化了对细胞多能性和基因组重编程的认识,再次掀起了干细胞研究的热潮。iPSC结合基因治疗和细胞治疗的成果已经应用到动物疾病模型上。iPSC能够自我更新并维持未分化状态,可分化为3个胚层来源的所有细胞,参与形成机体所有组织和器官,体外定向诱导能够分化出各种成体细胞,在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。但iPSC技术也存在一系列问题需要研究解决。     

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。     

表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为研制一种预防犬科动物狂犬病的新型疫苗,将含有狂犬病毒ERA株糖蛋白基因(Rabies glycoprotein,Rgp)表达盒的穿梭质粒pVAXΔE3Rgp中的Rgp表达盒克隆入犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2,CAV2)骨架质粒pPoly2-CAV2中,获得重组质粒pPoly2-CAV2-ΔE3-Rgp,释放其基因组,转染MDCK细胞系,获得E3缺失区(Deletion of early protein3,ΔE3)含有Rgp表达盒的重组病毒CAV2-ΔE3-Rgp。该重组病毒能在MDCK细胞上产生典型的腺病毒细胞病变。通过酶切、PCR、基因测序,表明该重组病毒含有完整的Rgp表达盒。通过RT-PCR、Western blot等检测,表明该重组病毒能够表达Rgp抗原。用该重组病毒免疫犬,3次免疫后,可以诱导犬产生特异的抗CAV2HI抗体,其效价超过1∶256和抗狂犬病病毒(Rabies virus,RV)中和抗体,其效价超过0.50IU/mL。试验结果表明,获得的重组病毒免疫犬后,能够产生抗狂犬病毒和腺病毒的高效价保护性抗体,是一种有潜力的犬科动物狂犬病毒腺病毒二联疫苗候选株。     

熊猫等动物犬瘟热病毒附着蛋白基因的遗传多样性

为了研究犬瘟热病毒（ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ,ＣＤＶ）大熊猫株、小熊猫株和长春犬株附着蛋白（Ｈ）基因的遗传这异,对Ｈ基因进行了序列测定。上述３个ＣＤＶ毒株的Ｈ基因全长均为１９４６ｂｐ,开放阅读框架（ＯＲＦ）始于２１－２３位的ＡＴＧ,终止于１８４２－１８４４位的ＴＧＡ,编码６０７个氨基酸。与ＧｅｎＢａｎｋ中１５个ＣＤＶ株推导的Ｈ蛋白氨基酸序列比较发现,１６个野毒株潜在的Ｈ－联糖基     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

虎血清H5 亚型流感病毒抗体调查

为查明我国圈养虎群中H5 亚型流感病毒的流行情况,应用血凝抑制(HI)方法检测了1998 ～ 2009 年间采集于哈尔滨、宜昌、桂林、唐山、上海和郑州等地的309 份虎血清样品的H5 亚型流感病毒抗体效价。结果发现1998 年4 月至2002 年4 月采集的20 份血清样品全部为H5 亚型流感病毒HI 抗体阴性。在2002 年7 月至2003
年6 月采样于上海、唐山、哈尔滨的34 只虎中,有31 只曾出现过高热、抽搐和肺炎症状,其中24 只虎的血清样品H5 亚型流感病毒HI 抗体呈阳性(抗体效价1∶ 10 ～ 1∶ 320),2 只无临床症状虎也为抗体阳性。对2004 年随机采集自哈尔滨的220 份血清样品调查发现抗体阳性率可达25.9% ,其中28 只有临床高热与肺炎病史的虎中有14 只抗体呈阳性(抗体效价1∶ 10 ～1∶ 80),其余无病史的192 只虎中有43 只抗体阳性。2009 年8 月采集的35 份血清中仅有3 份H5 阳性,抗体阳性率下降为8.6% 。上述结果表明H5 亚型流感病毒能够感染虎并对圈养虎的健康构成威胁,而且其公共卫生意义更值得关注。     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体.首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV-VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX△E3VP2.用Sal I+Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2.Cla I+Asc I酶切pCAV-2-FPV-VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2.该重组病毒能使MDCK细胞产生腺病毒样细胞病变.Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白.该重组病毒可以有效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体.本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株.     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichiapastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断.用特异性引物扩增出CCVDXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1.用KpnI和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZ αAS1.将pPICZαAS1用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子.用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测.结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应.凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右.用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达18-116,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性.     

犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究

对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6%、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3%,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大。国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-175个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性。基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型。另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%。     

重组虎源H5N1流感病毒HA基因犬2型腺病毒的构建与实验免疫研究

H5N1流感病毒可以对虎和猫产生致死性感染,为研制可用于预防猫科动物流感的新型疫苗,构建了重组虎源H5N1流感病毒HA基因的犬2型腺病毒。将A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)的HA基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有HA基因的表达盒(CMV HA PolyA)克隆入pVAXΔE3的SSPⅠ酶切缺失处,获得含有HA表达盒的穿梭载体pΔEHA。用SalⅠ NruⅠ分别对pΔEHA和pPoly-2-CAV2进行双酶切,将含有HA表达盒的SalⅠ NruⅠ片段克隆入pPoly2-CAV2,获得了在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2/HA。释放CAV-2/HA重组基因组转染MDCK细胞,获得了重组活病毒CAV2/HA,经Western blot分析表明重组表达产物可被流感病毒HA单克隆抗体3A13所识别。使用该重组病毒免疫猫可以产生效价为1∶8~1∶16的抗H5亚型流感病毒血凝抑制抗体。