Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究

为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV)UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中。将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定。用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白。同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位。结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体。该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础。     

人体肠道细菌寡营养培养组条件的优化研究

【目的】探讨寡营养对人体肠道细菌培养组的条件。【方法】通过稀释富集培养基、固体平板和增菌肉汤培养基成分获得寡营养培养基。对健康人粪便样本分别用原液(0)、5、10、20、30和40倍稀释的富集培养基(添加羊血和瘤胃液的血培养瓶)连续增菌,在不同时间点(第0、3、6、9、15、27、30天)吸取增菌液,用YCFA (yeast casitone fatty acid)固体培养平板分离菌落;用YCFA增菌肉汤增菌后再次挑取单菌落,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF)质谱和16S rRNA基因测序鉴定菌株。通过比较上述6种寡营养条件分离肠道菌群的效果,选取富集培养基原液、稀释10倍和30倍这3 种条件下分离效果较好的富集条件,与同样稀释倍数条件的固体平板和增菌肉汤分别组合成9种培养基条件,进一步优化肠道菌群的培养组条件。【结果】在6种寡营养富集培养基中,未稀释(原液)、10 倍和30倍稀释的富集培养基分离细菌的种类比其他...     

马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法

为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT FC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDVmeq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗。     

马立克氏病毒meq基因缺失株SC9-1通过自然重组获得meq能力的分析北大核心CSCD

为了探究meq基因缺失的马立克氏病毒疫苗株SC9-1与超强毒株Md5是否能够通过自然重组获得meq基因的能力,将SC9-1疫苗毒和Md5超强毒共同感染鸡胚成纤维细胞(CEF),并在CEF上连续传三代,提取单个蚀斑的病毒DNA。同时将Md5超强毒接种免疫过SC9-1疫苗株的SPF鸡,在不同的时间点分离病毒,提取单个蚀斑的病毒DNA。将两种方式获得的病毒DNA进行PCR验证,并将香啤酒重组酶位点(FRT)残留序列克隆测序,比较其同源性。两种方式鉴定的病毒均为SC9-1或是Md5,没有检测到重组病毒,而且FRT残留序列同源性为100%。结果 SC9-1没有从野生毒株Md5获得缺失的meq基因,而且meq基因敲除区具有很好的遗传稳定性。     

利用培养组学技术分离鉴定体外降解胆固醇肠道细菌及其功能评价

高胆固醇是诱发心脑血管疾病的重要因素之一。目前国内外降低胆固醇的主要方式是药物治疗,但其存在费用高及副作用多的弊端。研究表明,肠道细菌对机体的胆固醇代谢有重要影响,但降胆固醇肠道细菌的筛选方式及功能评价却少有报道。本研究通过培养组学方法,使用牛胆汁酸或人工混合胆汁酸作为筛选条件,从健康人体肠道筛选出36种耐胆汁酸细菌。以鼠李糖乳杆菌GG株 (Lactobacillus rhamnosus GG,LGG) 作为阳性对照,设置0 g/L、0.3 g/L、3 g/L三种胆汁酸浓度组,对耐胆汁酸细菌进行体外降胆固醇能力评估,确定奇异变形菌、斯氏普罗威登斯菌、普通变形菌等10种细菌为降胆固醇优势菌。随后对其中6种降胆固醇优势菌——奇异变形菌、斯氏普罗威登斯菌、普通变形菌、潘氏变形菌、污蝇解克杆菌、雷氏普罗威登斯菌进行体外降甘油三酯能力评估以及人工胃液耐受能力评估。结果显示,上述6株细菌体外降甘油三酯能力均优于LGG。伴随人工胃液pH值的下降和作用时间的延长,6株细菌的生存率均下降。上述筛选实验及功能评价为进一步开发潜在的降胆固醇细菌制品提供研究基础。     

马立克氏病毒meq基因缺失株SC9-1通过自然重组获得meq能力的分析

为了探究meq基因缺失的马立克氏病毒疫苗株SC9-1与超强毒株Md5是否能够通过自然重组获得meq基因的能力,将SC9-1疫苗毒和Md5超强毒共同感染鸡胚成纤维细胞(CEF),并在CEF上连续传三代,提取单个蚀斑的病毒DNA。同时将Md5超强毒接种免疫过SC9-1疫苗株的SPF鸡,在不同的时间点分离病毒,提取单个蚀斑的病毒DNA。将两种方式获得的病毒DNA进行PCR验证,并将香啤酒重组酶位点(FRT)残留序列克隆测序,比较其同源性。两种方式鉴定的病毒均为SC9-1或是Md5,没有检测到重组病毒,而且FRT残留序列同源性为100%。结果 SC9-1没有从野生毒株Md5获得缺失的meq基因,而且meq基因敲除区具有很好的遗传稳定性。