菜粉蝶野田村病毒感染宿主的病理学变化及病毒的装配

应用光学组织切片和电镜超薄切片技术对菜粉蝶新的野田村病毒感染菜青虫幼虫的组织病理学和超微病理学变化以及菜青虫颗粒体病毒混合感染后的病理学变化进行了研究.结果表明该病毒只在菜青虫中肠细胞质内增殖.病毒侵染时,线粒体、内质网等细胞器均发生显著病变.该病毒与前人报告的能侵染菜青虫的其它病毒均有所不同.本文还讨论了野田村病毒的装配.     

文山松毛虫质型多角体病毒（DpwCPV）NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus Wenshanensis cytoplasmic polyhedrosis virus, DpwCPV)的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS热酚法抽提得到基因组dSRNA,使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化第九片段S9。S9 RNA双链经高温变性,逆转录合成cDNA双链。根据DpwCPV与BmCPV1的同源性设计引物,将S9进行PCR扩增后,克隆到PMD18T载体上。最终获得一个977bp的序列,其中包含一个963bp的开放阅读框(ORF)。推测DpwCPV S9基因编码一个320个氨基酸的蛋白,分子量约为35560。     

小菜粉蝶颗粒体病毒颗粒体蛋白基因的序列测定及在大肠杆菌中的表达

根据颗粒体病毒颗粒体蛋白(Granulin)基因在其起始密码子上游的12个碱基高度保守序列(TATAAGGAATTT)以及大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)的颗粒体蛋白基因的序列[1]设计引物,PCR扩增得到850bp左右大小的片段,核苷酸序列测定结果表明该病毒的granulin基因全长为855bp,起始密码位于第38～40位碱基,终止密码位于779～781位碱基,编码框序列全长为744;推测该基因编码一段由247个氨基酸组成的多肽,分子质量约为2.9178×104道尔顿.与其它颗粒体病毒颗粒体蛋白基因进行同源性比较,核苷酸同源性都在70%以上,氨基酸同源性都在75%以上,最高的为大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),核苷酸同源性为97%,氨基酸同源性为98%.构建了重组表达载体pet-28a-Gran,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测,表明获得了颗粒体蛋白基因在大肠杆菌BL21中的特异表达.     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析

本文利用T4 RNA连接酶将5'-磷酸、3'-氨基修饰的引物1连接到马尾松毛虫质型多角体病毒第8片段dsRNA的3'-OH端.经逆转录、退火、补齐形成全长双链cDNA.使用单一的互补引物2进行PCR扩增.扩增产物克隆在pMD18-T载体上.对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定,结果表明,克隆片段全长330bp,S'端具有CPV-1型末端保守序列AGTAAA'端具有保守序列GTTAGCC.起始密码子从ATG位于38-40残基,终止密码子TAA位于1208～1210残基.推测S8片段编码390个氨基酸多肽,分子量为44kDa.与舞毒蛾质型多角体病(LdCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97%和98%.与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83%和85%.与人的呼肠孤病毒第8片段比较没有明显的同源性.     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)是我国分布最广的蟑螂种类.黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)是我室1991年在国内首次报道并在国内外第一个分类鉴定的蟑螂细小病毒[1].我们构建了PfDNV全基因组克隆和酶切亚克隆重组质粒,测定并分析了病毒基因组全序列与结构.序列分析表明该病毒基因组具有细小病毒基因组的结构特征,其末端具有反转重复序列(Invert Terminal Repeatant, ITR)和回文结构,这类病毒基因组两端的特殊结构可能是与病毒复制,整合,拯救,包装有关的必需顺式元件[2～5].为了进一步研究黑胸大蠊浓核病毒基因复制及表达机理,尤其是其末端结构在病毒基因复制中的作用,我们将荧光素酶基因插入了PfDNV基因组保留了两个完整的末端结构而其它部分缺失的重组质粒中.将这种重组质粒转染虫体后,在虫体中检测到了荧光素酶的表达,说明在缺失基因组中间部分时,插入的外源基因依然可以复制、表达.本结果证实了PfDNV基因组的末端结构是PfDNV复制的必需结构.这一实验为将外源基因引入病毒基因组,构建基因工程杀虫剂提供了有效的技术途径.现将结果报告如下.     

白蚁信息素研究进展

采用信息素防治白蚁这种世界性害虫是当前白蚁研究的一大热点。本文从化学和生物两个方面总结了几十年来国内外白蚁信息素及其类似物研究进展。讨论了影响信息素活性的几个因素。并根据最新的研究情况,对今后的信息素及其类似物的理论研究和应用情况进行了展望。     

重组质粒转染蟑螂对黑胸大蠊浓核病毒的拯救

用Glassmilk法纯化PfDNV dsDNA,在其3′端和PstⅠ切开的pUC119质粒的3′端分别加dG和dC尾,连接、转化、筛选得到分子量为8.7kb的重组质粒.通过酶切证明插入DNA为PfDNV全基因组DNA.利用DEAE-dextran转染技术,将此重组质粒导入黑胸大蠊幼虫体内,此重组质粒能使虫体发病死亡.电镜超薄切片观察发现虫体细胞内存在大量的病毒粒子.同样,在免疫扩散实验中虫体PBS浸出液能与抗PfDNV的抗体产生沉淀线.用重组质粒感染致死的虫体喂食健康黑胸大蠊,也能使其发病死亡,通过电镜可以观察到在细胞内增殖的病毒粒子.     

腮腺炎病毒的结构多肽——分子量的电泳测定

腮腺炎病毒感染鸡胚后收集尿液和羊水,通过差异离心和蔗糖密度梯度离心提纯宥毒。经SDS—PAGE分离,以铬银染色法结合溴化乙锭和考马斯亮兰染色,发现病毒含有13种结构多肽,分子量分别为79,74,70,65,61,59,56,53,50,45,41,34和31 x103d。