银杏叶提取物对自由基所致脑神经细胞损伤的保护作用研究

从细胞分子水平,采用大脑皮层神经细胞分离技术,自旋标记技术,酶学方法及细胞染色技术探讨自由基对神经细胞的损伤及ＥＧｂ保护作用。结果显示,用自由基攻击的细胞其自旋标记膜的序参数Ｓ,旋转相关时间τｃ及膜蛋白巯基的Ｓ／Ｗ比对照组高（Ｐ＜０．０５）,提示：受自由基攻击的细胞膜,其流动性比正常减低,且蛋白质构象发生了改变。加ＥＧｂ保护后,可减少自由基引起的膜流动性及蛋白质构象改变,起到保护神经细胞的作用。经·ＯＨ攻击的神经细胞,其ＬＤＨ活性及死细胞比率都比对照组高,而ＥＧｂ对此有保护作用。本文结果说明一定浓度ＥＧｂ可保护大脑皮层神经细胞免受自由基的损伤。     

H_2O_2－Fe~（3＋）所致人淋巴细胞DNA双链断裂损伤

采用脉冲电场凝胶电泳法检测Ｈ２Ｏ２－Ｆｅ（３＋）体系产生的ＯＨ对人淋巴细胞ＤＮＡ的双链断裂损伤．Ｈ２Ｏ２－Ｆｅ（３＋）浓度与ＤＮＡ双链断裂呈明显量效关系;随ＯＨ作用时间延长,细胞ＤＮＡ双链断裂加重;过氧化氢酶对ＯＨ损伤有明显抑制作用．脉冲电场凝胶电泳法可检测到的Ｈ２Ｏ２和ＦｅＣｌ３引起细胞ＤＮＡ双链断裂的最低浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和６μｍｏｌ／Ｌ．     

人心肌缺血/再灌注期间红细胞膜分子流动性改变的机理研究

对开心手术病人心肌缺血／再灌注过程中冠状静脉窦血中的红细胞流变性变化和红细胞膜分子结构的改变进行了研究。结果表明,再灌注即刻心脏产生大量自由基,并持续到再灌注第２０分钟时才大幅度回落;于再灌注后的２０分钟的自由基产生时相期间,除红细胞膜蛋白分子和脂质分子的τｐ、τｌ均明显延长外,还伴有血浆ＭＤＡ水平的明显增加和ＳＯＤ活性的显著降低,及红细胞内ＧＳＨ－Ｐｘ活性升高;与此同时其红细胞膜蛋白分子的α螺旋先减少后渐回复和β折叠渐增加并伴有羧基（ＣＯＯＨ）和氨基（ＮＨ３）的减少,而其红细胞膜脂质分子的磷氧双键（Ｐ＝Ｏ）、羰基（Ｃ＝Ｏ）和多不饱和键（Ｃ＝Ｃ）则增加;说明（１）再灌注期间氧自由基分别引起了红细胞膜蛋白分子碳端和氮端的改变及膜磷脂分子亲水区和疏水区化学结构的变化,（２）蛋白分子碳、氮端的变化造成了膜蛋白分子构象的改变,（３）蛋白分子和磷脂分子化学结构及构象的改变是红细胞膜这些分子流动性明显恶化的根本原因。     

重复缺氧与过氧化氢对脑与突触体乳酸生成的影响

目的：观察重复缺氧对小鼠在体脑乳酸含量以及Ｈ２Ｏ２对荷兰猪离体突触体乳酸含量的影响,并分析其作用机制。方法：采用酶氧化方法对突触体培养液中乳酸含量进行测定。结果：单次急性缺氧鼠脑内乳酸含量高,但在重复缺氧的作用下,鼠脑内乳酸的含量并未随缺氧时间的延长而增加。在突触体培养液中分别加入Ｈ２Ｏ２、ＦＣＣＰ、Ｒｏｔｅｎｏｎ,乳酸浓度比正常对照组显著性的增高。对突触体进行长时间Ｈ２Ｏ２处理,乳酸含量未见显著升高或降低。同时在突触体培养液中加入Ｈ２Ｏ２和ＦＣＣＰ,乳酸浓度相当于单独在突触体培养液分别加入Ｈ２Ｏ２与ＦＣＣＰ产生乳酸之和。结论：重复缺氧与Ｈ２Ｏ２处理可能激发脑与突触体内的抗自由基损伤防御系统;突触体从有氧呼吸到无氧酵解的转换主要不是由于Ｈ２Ｏ２对突触体膜的损伤。     

自由基损伤红细胞膜分子的机理研究

为探明自由基对红细胞膜脂质及蛋白分子损伤机理,本文通过电子自旋共振波谱仪（ＥＳＲ）、激光拉曼波谱仪、圆二色波谱仪（ＣＤ）、显微付立叶变换红外波谱仪（ＭＦＴ－ＩＲ）和表面电子能谱分析系统（ＥＳＣＡ）分别对体外自由基作用３０分钟后,及作用后３小时红细胞膜整体结构、膜蛋白分子及脂质分子进行了分析。结果发现,自由基作用后①红细胞膜中β－胡萝卜素构象由伸展变为卷曲,提示膜整体结构改变,②膜蛋白分子二级结构变化,表现为α螺旋减少和β折叠增加,③膜蛋白分子二硫键与巯基的比例增加（Ｓ－Ｓ／ＳＨ）、亚氨基（ＮＨ）和羰基含量改变,同时蛋白分子的氢键也被破坏（如ＮＨ、ＣＯＨ等基团的减少和ＮＣ、ＣＯ的增加）,④膜脂分子磷氧双键（Ｐ＝Ｏ）成分、羰基成分（Ｃ＝Ｏ）、碳－碳双键（Ｃ＝Ｃ）成分降低;说明自由基导致红细胞膜蛋白及脂质分子化学结构改变是造成膜分子构象及膜整体结构改变的根本原因。３小时后无论是膜蛋白二级结构、二硫键与巯基比或膜脂分子Ｐ＝Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｃ不仅没有恢复,反而有加重趋势。这说明了自由基损伤的部分不可逆性     

渗透胁迫下水稻幼苗中叶绿素降解的活性氧损伤作用

水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）幼苗在渗透胁迫下,随着胁迫强度的增加及时间的延长,Ｃｈｌ降解加剧,活性氧Ｏ－·２ 、Ｈ２Ｏ２ 及脂质过氧化产物丙二醛（ＭＤＡ）含量明显增加,抗氧化剂抗坏血酸（ＡｓＡ）还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）及胡萝卜素（ＣＡＲ）含量显著降低,叶绿素蛋白复合体（Ｃｈｌ－Ｐｒｏ）结合度松弛． Ｃｈｌ含量的降低和Ｏ－·２ 、Ｈ２Ｏ２ 及ＭＤＡ 含量呈显著的负相关,与ＡｓＡ、ＧＳＨ及ＣＡＲ含量的下降呈良好的正相关性．ＡｓＡ、α－生育酚（ＶｉｔＥ）及甘露醇预处理可使胁迫诱导的ＭＤＡ 增多及Ｃｈｌ降解延缓,而Ｆｅ２＋ 、Ｈ２Ｏ２ 及Ｆｅｎｔｏｎ 反应则刺激ＭＤＡ 增加． Ｆｅｎｔｏｎ 反应可加速Ｃｈｌ降解． 渗透胁迫下水稻幼苗Ｃｈｌ的降解可能主要是由Ｏ－·２ 和Ｈ２Ｏ２ 的代谢产物·ＯＨ氧化损伤之故     

邻二氮菲－Fe~（2＋）氧化法检测H_2O_2／Fe~（2＋）产生的羟自由基

报告检测Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ２＋所产生羟自由基的新方法．羟自由基氧化反应后,邻二氮菲－Ｆｅ２＋的Ａ５３６明显下降,且△Ａ５３６与邻二氮菲,ＦｅＳＯ４及Ｈ２Ｏ２呈量效关系,随反应时间延长,△Ａ５３６依幂函数规律上升．此法试验结果表明,甘露醇,抗坏血酸及硫肥清除羟自由基作用呈明显的量效关系．     

高铁离子自由基与亚油酸反应的初步研究

利用停留仪快速反应动力学方法和自旋捕集ＥＳＲ技术监测高铁离子自由基和自旋捕捉剂ＰＯＢＮ的反应,发现高铁离子自由基本身不被自旋捕捉剂ＰＯＢＮ捕捉,但是ＰＯＢＮ可以捕捉到停流仪第三相中的ＯＨ,可能来自剩余的Ｆｅｎｔｏｎ试剂或高铁离子自由基的衰变。以含两个双键的不饱和脂肪酸－亚油酸（ＬＨ）作为模型化合物,测定高铁离子自由基与亚油酸分子的反应速率。ＥＳＲ结果表明,高铁离子自由基可能在一定程度上启动了亚油酸体系的脂质过氧化。     

抗氧化剂对HeLa细胞在竹红菌甲素（HA）光敏损伤下的保护作用的研究

通过细胞台盼兰拒染检测、电镜观察以及＾３Ｈ－Ｔｄｒ同位素掺入等方法,分别从细胞水平及分子水平上,定性定量测定了维生素Ｅ、丁羟基甲苯（ＢＨＴ）、阿魏酸钠（ＳＦ）三种抗氧化剂对于竹红菌甲素（ＨＡ）光敏所致ＨｅＬａ细胞损伤的抑制。结果表明：三种抗氧化剂对于细胞的损伤均有不同程度的抑制作用,其中ＶｉｔＥ的抑制作用最明显,ＢＨＴ及ＳＦ的抑制作用则较弱,提示脂质过氧化在细胞膜和细胞核损伤中起着重要的作用。     

生长抑素对羟自由基损伤的人胃粘膜上皮细胞系GES—1的影响

目的和方法：采用人胃粘膜上皮细胞系ＧＥＳ１细胞传代培养技术,利用Ｆｅ２＋与Ｈ２Ｏ２反应生成的羟自由基（ｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ,ＯＨ·）建立细胞损伤模型,探讨ＯＨ·损伤人胃粘膜细胞的机制,观察生长抑素（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ,ＳＳ）对ＧＥＳ１细胞抗ＯＨ·损伤的影响。结果：（１）ＯＨ·可直接损伤ＧＥＳ１细胞,表现为细胞存活率下降而细胞乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＬＤＨ）漏出量增多;预先在细胞培养液中加入ＯＨ·特异性清除剂二甲基亚砜（５ｍｍｏｌ／Ｌ）,可预防该损伤。预先加入ＳＳ（０．０１ｍｇ／Ｌ,０．１ｍｇ／Ｌ,１．０ｍｇ／Ｌ,１０ｍｇ／Ｌ）对细胞存活率和细胞ＬＤＨ漏出量无影响;（２）加入ＯＨ·后,细胞丙二醛（ＭＤＡ）、氧化型谷胱甘肽（ＧＳＳＧ）含量上升而还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量下降。以ＳＳ０．１ｍｇ／Ｌ,１．０ｍｇ／Ｌ,１０ｍｇ／Ｌ预处理,可部分减轻上述改变。结论：ＯＨ·可直接损伤ＧＥＳ１细胞,其机制与破坏细胞的巯基稳态及加重细胞的脂质过氧化程度有关;ＳＳ可通过维持细胞的巯基稳态,部分减轻ＯＨ·所致的ＧＥＳ１细胞脂质过氧化程度。     

抗氧化剂对HeLa细胞在竹红菌甲素（HA）光敏损伤下的保护作用的研究

通过细胞台盼兰拒染检测、电镜观察以及３Ｈ—Ｔｄｒ同位素掺入等方法,分别从细胞水平及分子水平上,定性定量测定了维生素Ｅ（ＶｉｔＥ）、丁羟基甲苯（ＢＨＴ）、阿魏酸钠（ＳＦ）三种抗氧化剂对于竹红菌甲素（ＨＡ）光敏所致ＨｅＬａ细胞损伤的抑制作用。结果表明：三种抗氧化剂对于细胞的损伤均有不同程度的抑制作用,其中ＶｉｔＥ的抑制作用最明显,ＢＨＴ及ＳＦ的抑制作用则较弱,提示脂质过氧化在细胞膜和细胞核损伤中起着重要的作用。     

自由基对红细胞钙调机制的影响

为探讨自由基对红细胞钙调机制的影响, 采用荧光标记的方法, 分别观察了健康人的红细胞在单纯Ｆｅｎｔｏｎ 反应体系作用下和钙通道阻断剂＋ Ｆｅｎｔｏｎ 体系作用下胞内钙浓度的动态变化。发现：（１） 在Ｆｅｎｔｏｎ 体系开始作用２ ～３ 分钟后,红细胞内钙浓度才突然地急剧增加,此后便维持在一个明显低于胞外浓度的稳定水平;（２） 在Ｆｅｎｔｏｎ 体系作用前后, 采用钙通道阻断剂镍可防止胞内钙的增加或使胞内钙浓度逐渐降至作用前水平。以上结果说明, 在Ｆｅｎｔｏｎ 体系作用下, 红细胞仍保持对胞内异常高钙的清除能力,即自由基并不完全损害红细胞的钙调机制     

用自旋捕集技术研究硒化合物对活性氧自由基的清除作用

亚硒酸钠,硒代甲硫氨酸和硒代硫酸软骨素对黄嘌呤氧化酶体系和人多形核白细胞（ＰＭＮ）呼吸暴发时产生的超氧阴离子（Ｏ）自由基;和Ｆｅｎｔｏｎ反应生成的羟自由基（·ＯＨ）有明显的清除作用,并抑制ＰＭＮ呼吸暴发时对氧的消耗。实验结果说明不同硒化合物不仅能够清除细胞体系产生的活性氧自由基,而且对化学反应生成的活性氧自由基也有清除作用。     

渗透胁迫下稻苗中铁催化的膜脂过氧化作用

在－０．７ＭＰａ渗透胁迫下,水稻幼苗体内和Ｈ２Ｏ２大量产生,Ｆｅ２＋积累,膜脂过氧化作用加剧。水稻幼苗体内Ｆｅ２＋含量与膜脂过氧化产物ＭＤＡ含量呈极显著的正相关。外源Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｈ２Ｏ２、Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２、ＤＤＴＣ均能刺激膜脂过氧化作用,而铁离子的螯合剂ＤＴＰＡ则有缓解作用。ＯＨ的清除剂苯甲酸钠和甘露醇能明显地抑制渗透胁迫下Ｆｅ２＋催化的膜脂过氧化作用。这都表明渗透胁迫下水稻幼苗体内铁诱导的膜脂过氧化作用主要是由于其催化Ｆｅｎｔｏｎ型Ｈａｂｅｒ－Ｗｅｉｓｓ反应形成ＯＨ所致。     

纤维二糖脱氢酶生成羟自由基和还原各种自由基的研究

利用电子顺磁共振（ＥＳＲ）技术和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）反应研究了纤维二糖脱氢酶（ＣＤＨ）生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．以纤维二糖为电子供体时,ＣＤＨ可以生成·ＯＨ．·ＯＨ生成量与ＣＤＨ、Ｆｅ３＋和Ｏ２的浓度有关．加入过氧化氢酶可使·ＯＨ的生成明显减少．ＣＤＨ可以还原自旋加合物［ＰＢＮ－ＯＨ］·、氮氧自由基和天然木素分子中的自由基．结果表明,ＣＤＨ具有生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．对该酶在木质纤维素降解中的作用进行了探讨     

金属硫蛋白清除自由基及其对自由基引起的核酸损伤保护作用的研究

通过化学反应体系产生ＯＨ－和Ｏ自由基,采用荧光和化学发光检测体系,比较研究了不同亚型及不同结合金属的金属硫蛋白（ＭＴ）清除自由基能力的大小。结果表明,对于同一亚型,Ｚｎ结合ＭＴ清除自由基的能力大于Ｃｄ结合ＭＴ同一结合金属的ＭＴ,ＭＴ１清除自由基的能力大于ＭＴ２。通过比较ＺｎＭＴ１与谷胱甘肽（ＧＳＨ）及超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）清除自由基的能力大小发现,ＺｎＭＴ１清除ＯＨ的能力是ＧＳＨ的１００倍,清除Ｏ自由基的能力分别是ＧＳＨ和ＳＯＤ的２５和０．０１倍。即ＭＴ是一种很好的ＯＨ自由基清除剂。以ＯＨ对核酸（ＤＮＡ）的损伤为例,研究了ＭＴ对核酸损伤的保护作用,其变化规律与上述结果相一致。     

天然抗氧化剂丹参酮Ⅱ—A对肝细胞脂质过氧化产物与DNA相互作用的影响

［３Ｈ］花生四烯酸标记的肝细胞,经ＦｅＣｌ２－ＤＴＰＡ启动脂质过氧化后,细胞ＤＮＡ出现放射性,并随保温时间增加而逐渐增高,表明在细胞内脂质过氧化产物与ＤＮＡ发生相互作用,生成了一种ＤＮＡ加成物,经测定它具有特征荧光光谱,显示较低的增色效应和Ｔｍ值。用高度敏度荧光图象显微镜直接观察发现丹参酮Ⅱ－Ａ经细胞摄取后主要滞留在细胞膜与胞浆中。它能有效地抑制细胞脂质过氧化,减少脂质－ＤＮＡ加成物的产生,并阻止了细胞存活率和Ｏ６甲基鸟嘌呤转移酶活性的降低,其抑制率与ＶｉｔＥ,ＢＨＴ相近,但显著高于ＮａＮ３,甘露醇和ＳＯＤ。上述结果提示丹参酮Ⅱ－Ａ是一种新的有效的细胞内脂质过氧化产物与ＤＮＡ相互作用的抑制剂。它对ＤＮＡ的保护作用可能是通过清除脂类自由基而阻断脂质过氧化的链式反应,抑制ＤＮＡ加成物的生成,从而减少了细胞毒性。     

羟墓自由基引起神经细胞［Ca~（2＋）］i增高的机制和Ebselen的抑制作用

用Ｆｕｒａ－２显微荧光测量技术研究了羟基自由基对单个皮层神经细胞内游离钙离子浓度［Ｃａ２＋］ｉ影响和硒化合物Ｅｂｅｌｅｎ对［Ｃａ２＋］ｉ的抑制作用。结果表明羟基自由基的作用首先引起胞内［Ｃａ２＋］ｉ以时间常数τ＝３８９５．４±５０７．２Ｓ速度缓慢增加,然后加入了以τ＝４２０．６±１２２．０Ｓ的外钙大量涌入。钙通道阻断剂、疏基还原剂、疏基还原制和自由基清除剂对羟基自由基损伤作用的影响提示外钙的大量涌入部分与通道的开放有关,疏基损伤在羟基自由基引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高中起着重要的作用。具有类谷胱甘肽过氧化酶活性的小分子硒化合物Ｅｂｓｅｌｅｎ（１０－５ｍｏｌ／Ｌ和１０－６ｍｏｌ／Ｌ）抑制羟基自由基引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高,推测它可以抑制钙库的释放或促进内钙的外排以及抑制外钙的流入。     

树舌多糖CF2a溶液中构象行为的研究

根据刚果红实验,不同ＮａＣｌ浓度中分子量测定,不同ＮａＯＨ浓度,不同ｐＨ下［ａ］ｄ,ＣＤ谱及ηＳＤ／Ｃ的变化,推测ＣＦ２ａ在纯水中为三股螺旋,在稀盐溶液２中为单股螺旋,在ＤＭＳＯ－Ｈ２Ｏ体系中,体积分数φＨ２Ｏ降至０．２后三股螺旋解离为单股螺旋。在ＤＭＳＯ中单股螺旋随脲浓度增加转为无序结构,脲,酸,碱等影响氢键因素对ＣＦ２ａ水溶液之［ａ］Ｄ,ηＳＤ／Ｃ均有显著影响,表明维持ＣＦ２ａ在溶液中有序构象     

铜锌超氧物歧化酶对几种羟自由基产生系统的影响

应用脱氧核糖降解法研究了ＣｕＺｎ－ＳＯＤ对几种·ＯＨ产生系统的作用机理．结果证明：ＳＯＤ对Ｆｅ（３＋）·Ｏ·Ｈ２Ｏ２系统中·ＯＨ的产生有明显的抑制作用,而失活ＳＯＤ或ＢＳＡ对它的抑制作用不大;在Ｆｅ（２＋）·Ｈ２Ｏ２和ＣＵ（２＋）·Ｈ２Ｏ２系统中,ＳＯＤ、失活ＳＯＤ和ＢＡＳ均能抑制·ＯＨ的产生;在Ｆｅ（２＋）·Ｏ系统中,ＳＯＤ对·ＯＨ产生作用不大,而失活ＳＯＤ或ＢＳＡ对它有明显的抑制作用．由此推测ＳＯＤ对·ＯＨ形成可能有三方面的影响：１．对Ｏ的清除作用,阻断Ｈａｂｅｒ－Ｗｅｉｓｓ反应;２．对金属离子的络合作用,降低·ＯＨ的产额;３．促进Ｈ２Ｏ２的积累,加快Ｆｅｎｔｏｎ反应．