DNA损伤反应性蛋白参与中心体调控

中心体是动物细胞有丝分裂期微管组织中心,对于细胞有丝分裂期形成纺锤体、正常分裂及染色体精确分离至关重要. 中心体失调控常造成遗传物质错误分配,最终诱发肿瘤形成.因此,对中心体结构及数量的精密调控将对细胞命运起着决定 作用.目前发现,中心体至少包含100多种调节蛋白,这些蛋白在细胞内的功能各异.最近很多研究显示,多种DNA损伤修复及 应答通路的激酶或磷酸酶定位于中心体,并且参与中心体调控.本文将对中心体结构、中心体复制、中心体分离、中心体扩 增、DNA损伤与中心体异常及DNA损伤反应性蛋白在中心体调控中的功能作一综述.     

生物信息学辅助定位及延伸辐射诱导未知表达序列标签

研究辐射诱导的基因表达调控对于认识细胞对辐射损伤的应激反应有重要意义.在低剂量辐射诱导新基因RIG1表达序列标签(expression sequence tag,EST)片段的基础上,通过非克隆cDNA文库和RACE(rapid amplification of cDNA end)技术获得了其3′末端.依据实验得到的这两段EST序列所提供的信息,通过生物信息学分析将RIG1基因初步定位在20号染色体.对20号染色体RIG1区基因组序列进行外显子扫描,发现预测的外显子正好与实验得到的EST相吻合.利用预测的外显子设计特异引物,成功地克隆了RIG1基因全长序列.同时,对20号染色体RIG1区的生物信息学分析表明,在RIG1基因的上游存在启动子区,从而确定了RIG1基因的基因组序列.因此,通过生物信息学辅助设计实验,快捷地定位及延伸了未知EST片段RIG1,基本完成了RIG1的全基因、基因组序列及染色体定位研究.     

Mitotic Catastrophe的研究进展

细胞死亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象,可分为坏死和程序性细胞死亡,而后者根据死亡细胞的形态学和发生机制的不同又可分为凋亡、自吞噬和mitotic catastrophe,其中mitotic catastrophe是近年来才被揭示报道,是指细胞在有丝分裂过程中死亡的现象,是一种发生在细胞有丝分裂期由于异常的细胞分裂而导致的细胞死亡,它常常伴随着细胞有丝分裂检查点的异常和基因或纺锤体结构的损伤而发生。现对mitotic catastrophe及相关的调控机制进行综述。     

与细胞周期G2/M期进程相关的H2AX磷酸化

γH2AX焦点(foci)被普遍当做DNA双链断裂（DSB）损伤的分子标志物.为探 讨细胞周期进程相关的H2AX磷酸化规律特征,采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑(nocodazole)的后续处理,将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期．然后,用流式细胞仪检测细胞周期、Western印迹和免疫荧光法,观察γH2AX表达和γH2AX焦点的形成．结果显示,细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中,γH2AX水平显著增加 ;在无DNA DSB发生的情况下,部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点．随着细 胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期,γH2AX的表达水平逐渐降低．这种 γH2AX表达变化特征与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似． 在4 Gy大剂量照射下,HeLa细胞于照后8 到12 h出现明显的G2/M期阻滞．γH2AX 焦点数在照后1 h达高峰,随后降低,照后8 h又上升,出现了第2个峰值．与之不同的是,在1 Gy低剂量照射下,细胞的G2/M期阻滞微弱,γH2AX焦点数在照后 0.5 h最高,随后下降,且无反弹,符合DNA DSB的修复动力学特征．因此,将γ H2AX当做DNA DSB分子标志物时,还需要考虑细胞周期变化的影响．γH2AX适合 作为1 Gy以下照射的DNA双链断裂损伤的分子标志．     

沉默DNA-PKcs对细胞信号转导相关基因转录的影响

利用RNA干扰技术构建DNA-PKcs表达抑制细胞模型,探讨DNA-PKcs对HeLa细胞信号转导相关基因表达的调控作用.通过观察细胞对辐射及顺铂的敏感性,鉴定细胞表型变化.用寡核苷酸芯片检测细胞信号转导相关基因的转录谱,并用RT-PCR方法和SEAP检测系统进一步验证基因的表达变化.所筛选出的DNA-PKcs表达抑制细胞对辐射及顺铂的敏感性升高,15个与细胞信号转导相关的基因表达升高,其中7个是与干扰素信号转导反应相关的基因.8个表达下降,包括有细胞增殖分化相关基因,如NFAT.RT-PCR检测结果与芯片结果相一致,利用SEAT报告系统检测,进一步证实NFAT转录活性下调.实验结果表明,DNA-PKcs除了参与DNA修复外,还调控细胞信号转导相关基因的表达,而且大多与细胞增殖分化相关.     

微丝相关新蛋白hHBRK1相互作用蛋白质的鉴定

为了鉴定hHBRK1的相互作用蛋白,通过DNA重组构建重组表达质粒pGEXhHBRK1,并以谷胱甘肽Sepharose4B亲合层析法,获得纯化的重组融合蛋白GSThHBRK1.以小鼠心肌组织为研究对象,采用GSTpulldown技术结合Western印迹法,证实hHBRK1与小鼠心肌肌钙蛋白TEa亚型(EacTnT)相互作用.结果提示,hHBRK1与EacTnT结合,可能参与心肌微丝的聚合,为小鼠cTnT众多的剪接体,提供了一种可能的功能定位.     

组蛋白翻译后修饰与DNA损伤响应蛋白招募的调控

组蛋白翻译后修饰是细胞DNA损伤早期应答反应的重要内涵,一方面是松弛、开放染色质结构的必要分子调节事件,以便DNA损伤响应蛋白能接近DNA损伤位点;另一方面直接参与DNA损伤修复蛋白招募过程的调控。综述了在DNA损伤信号激发下,发生的组蛋白主要修饰类型,异组蛋白H2AX、H2A.Z在DNA损伤部位与组蛋白置换,及其对DNA损伤响应蛋白招募的调节作用和机制。     

PLK1是DNA内切酶CtIP的新相互作用蛋白

CtIP是DNA双链断裂修复中的关键蛋白之一,它能够促进断裂DNA末端切割,并且是一种已知的抑癌基因,与许多参与癌变过程的蛋白质如BRCA1,Rb等相互作用。为了更好地理解CtIP的分子网络,我们用在线工具PrePPI预测CtIP相互作用蛋白,发现PLK1是新的CtIP相互作用蛋白。PLK1在有丝分裂和癌症进展中发挥重要作用。我们进一步通过免疫沉淀法验证了它们的相互作用。 结果显示PLK1与CtIP有较强相互作用。此外,还采用Frodock 2.0工具对接CtIP和PLK1之间的蛋白质相互作用。最后,免疫沉淀测定和免疫荧光染色结果显示这两种蛋白质之间的相互作用与DNA损伤相关。基于这些结果,我们提出CtIP-PLK1相互作用可能在DNA损伤反应以及其他生物过程中发挥重要作用。     

H_2O_2－Fe~（3＋）所致人淋巴细胞DNA双链断裂损伤

采用脉冲电场凝胶电泳法检测Ｈ２Ｏ２－Ｆｅ（３＋）体系产生的ＯＨ对人淋巴细胞ＤＮＡ的双链断裂损伤．Ｈ２Ｏ２－Ｆｅ（３＋）浓度与ＤＮＡ双链断裂呈明显量效关系;随ＯＨ作用时间延长,细胞ＤＮＡ双链断裂加重;过氧化氢酶对ＯＨ损伤有明显抑制作用．脉冲电场凝胶电泳法可检测到的Ｈ２Ｏ２和ＦｅＣｌ３引起细胞ＤＮＡ双链断裂的最低浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和６μｍｏｌ／Ｌ．     

AT细胞DNA双链断裂重接修复效率及其忠实性

用脉冲电场凝胶电泳和双标记基因质粒ＤＮＡ转染技术研究辐射敏感的毛细血管扩张性共济失调症患者皮肤成纤维细胞（ＡＴ５ＢＩＶＡ）和正常辐射抗性的人宫颈癌细胞（ＨｅＬａＳ３）ＤＮＡ双链断裂重接修复率及其忠实性。结果表明γ射线照射诱发ＤＮＡ双链断裂的产额和重接修复率,在两株细胞间无差别．而ＡＴ细胞对导入的限制性内切酶ＥｃｏＲＶ产生双链断裂质粒ＤＮＡ的重接修复忠实性显著低于ＨｅｌａＳ３ｔｅ胞,表明ＡＴ细胞易发生ＤＮＡ错误修复,这很可能就是ＡＴ细胞高度辐射敏感性的主要原因。