屠宰绵羊卵巢卵母细胞的体外培养成熟

[目的] 探索把屠宰母羊卵巢卵母细胞在体外条件下培养成熟的有效处理方法和条件以便为体外受精技术的研究提供更多的成熟卵子。 [方法] 把从屠宰母羊新鲜卵巢的发育卵泡中采集的784枚卵母细胞分为3种类型,即A型(卵丘细胞层较完整的卵子)、B型(卵丘细胞层部分脱落的卵子)和C型(卵丘细胞、放射冠均脱落的裸卵)。并     

不需要血清共培养的受精卵培养系统的确立

机能性肽研究所确立了用无血清而且不需要体细胞的共培养的体外受精卵培养系统。目前与家畜改良事业团等正在利用牛未成熟卵体外成熟培养和体外受精后受精卵培养的无血清培养基进行评价试验及商品化探讨。开发血清和不需要共培养的无血清培养基为用于优良品种增产的牛受精卵移植技术的提高和普及做出了贡献。还期待着应用于人受精卵移植。 用于牛未成熟卵、受精卵培养的培养基目前需要添加牛胎儿血清并与卵丘/颗粒膜细胞共培养。但是,     

室温下保存的小鼠屠体卵巢GV卵的发育能力

将ICR系雌性小鼠处死并在10℃、15℃、20℃和25℃下依次保存8、14、24和48 h后,采集其体内的卵巢GV期卵,采用常规方法进行体外成熟和体外受精,获得的2细胞期胚经体外培养或胚胎移植观察其发育能力.其结果,在10℃下保存24 h、15℃下保存14 h、20℃下保存8h和25℃下保存4 h后,其体内附有卵丘细胞的GV卵的体外成熟-体外受精后的2细胞率分别为14%、9%、10%和10%,随着保存温度的提高和保存时间的延长,带有颗粒细胞GV期卵的比率明显降低,同时其GV期卵经体外成熟及体外受精后的2细胞率明显降低.在20℃下保存24 h和25℃下保存14 h时,难以获得形态正常的GV期卵;体外受精获得的2细胞期胚经体外培养,总体上有64%的胚胎发育至扩张囊胚,未见有保存温度和保存时间的显著影响,且利用在15℃保存8 h后的GV卵获得2细胞期胚的移植获得正常新生小鼠.上述结果表明,雌性动物室温条件下死亡后,若能短时间及时采集其体内GV期卵并体外成熟、体外受精,体外培养及胚胎移植技术,就有可能获得新生后代.     

绵羊卵核移植成功

英国AFRC动物生理研究所的S.M.Willadsen.博士(1986)利用细胞工程技术将绵羊未受精卵去核,而将绵羊发育早期胚胎的一个分裂球和去核卵融合,融合后的卵移植至母羊体中使其发育,成功地诞生了新的仔羊。受精卵在发生过程中,细胞核和细胞质双方均起着重要的作用,而细胞核移植则是研究发生过程中核     

卵母细胞的生发泡移植

生发泡(germinal vesicle,GV)移植到去核的GV期卵母细胞后,获得重构卵,重构卵在体外能成熟,受精和进行胚胎发育。GV移植到去核的第二次减数分裂中期(metaphase Ⅱ,MII)卵母细胞后,重构卵能发生GV破裂,但难以排出第一极体。GV移植后,通过连续核移植,重构合子具有发育到终期的能力。GV移植为研究卵母细胞的发育提供了一种重要工具。     

羊精子体外获能

本文发展了一种羊精子体外获能培养基——mTs或RSCM。羊精子在该培养基中(39℃.pH7.8和5％ CO_2,95％空气)预先培养7小时,可使大部分精子获能。获能精子呈现超激活运动,并可穿透去透明带仓鼠卵,穿透率分别为78.5±14.3％和96.7±2.3％,这种作用可被同种精浆逆转。获能精子与同种卵的受精率为83.3％。16个受精卵等量移入2只假孕兔输卵管壶腹部中。72小时后回收到12个胚胎。其中6个胚胎已发育为4—8细胞阶段,将这些细胞等量移入2只受体母羊输卵管壶腹部。其中1只妊娠,并维持到2个月之久。     

斑马鱼卵母细胞的体外成熟及成熟卵的受精发育

采用体外培养的方法,研究斑马鱼卵母细胞的成熟过程。Ⅳ时相初级卵母细胞在o．5μg／m1 17a－羟基孕酮的EM－199培养液中,80％氧气,25℃的体外培养条件下,在40min内,胚泡(GV)逐渐由卵母细胞中央至动物极边缘l／2处移到动物极边缘,进八V时相卵母细胞。30min后胚泡破裂(GVBD),胚泡破裂率为59％。此种卵母细胞继续培养2h才完全成熟。成熟卵不能从滤泡膜中自然排出。冷开水中剥离其外边的滤泡膜后加入具有受精能力的精子,即能使成熟卵受精,受精膜举起,胚盘在动物极形成。其后受精卵的分裂、发育等与自然成熟受精卵相同。以发育至囊胚为受精标准,这种体外成熟卵受精率为78％。这是斑马鱼卵母细胞体外培养成熟的首例报道。鱼类卵母细胞体外成熟技术的建立,为外源基因卵母细胞胚泡内转移奠定了基础。     

小鼠卵母细胞体外培养成熟及“试管小鼠”的研究

本文研究建立了一个有效的小鼠体外受精系:t。将小鼠附覃尾精子在简单合成的培荞液中休外获 能后,与体内成熟的卵母细胞共同孵育受精,然后体外培养。结果发育至2一细胞期胚胎的百分率为75一 85 %。将这些2一细胞期胚胎移植到受体小鼠输卵管,得到11只“试管小鼠”。用小鼠卵巢中未成熟卵母 细胞,经体外培养成熟后,沐外受精培养,达2一细咆期胚胎的百分率为20-40%,经移植后得到6只“试 管小鼠,,。     

试管牛繁殖能力的观察

利用屠宰母牛卵巢卵母细胞经过体外培养成熟、体外受精和体外发育后,以非手术移卵技术移植给受体母牛,于1989年8月15日出生的我国第一胎试管牛(雄性),现已达到繁殖年龄。为检测试管牛的繁殖能力,我们根据其自然交配情况以及采精后进行体外受精结果对其繁殖能力进行了研究评价。经过与5头母牛的情     

小鼠年龄及卵丘—卵母细胞间联接的解离对卵母细胞体外成熟的影响

实验研究了小鼠卵母细胞体外过程中卵丘－卵母细胞间的相互作用。实验小鼠为雌性Ｂ６Ｄ２杂交一代。激素处理４８小时后分离出卵后天和卵母细胞复合体,并培养在含有次黄嘌呤的培养液中。２４小时后检查卵母细胞核成熟情况。     

兔骨形态发生蛋白15 cDNA部分序列的克隆及其在卵母细胞中的表达

采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵巢中克隆出BMP15基因部分cDNA片段,经blast分析后,发现其与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的同源性达到了83%—90%。同时,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了BMP15mRNA在卵母细胞体外成熟培养过程中(IVM)的表达变化情况,结果表明:在兔卵母细胞体外成熟过程中,该基因在未成熟卵母细胞中表达水平较低,在培养16h其表达丰度达到峰值,并与卵丘扩展时间相一致,随后下降,推测BMP15可能在兔卵丘细胞扩展中发挥重要作用。     

兔骨形态发生蛋白15 cDNA部分序列的克隆及其在卵母细胞中的表达(英文）

采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵巢中克隆出BMP15基因部分cDNA片段,经blast分析后,发现其与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的同源性达到了83%—90%。同时,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了BMP15 mRNA在卵母细胞体外成熟培养过程中（IVM）的表达变化情况,结果表明：在兔卵母细胞体外成熟过程中,该基因在未成熟卵母细胞中表达水平较低,在培养16 h其表达丰度达到峰值,并与卵丘扩展时间相一致,随后下降,推测BMP15可能在兔卵丘细胞扩展中发挥重要作用。     

卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响

研究卵泡内环境对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育的影响。主要结果如下：直径≥5mm、4－4.9mm、3－3.9mm和2－2.9mm的卵泡卵母细胞体外成熟率分别为90.5%、89.7%、85.4%和67.4%,体外受精后,卵母细胞的发育能力随卵泡直径的增大而增强,直径≥5mm和4－4.9mm卵泡卵的2－细胞、3－4－细胞发育率显著高于直径2－2.9mm的卵泡卵（P＜0.05或0.01）。体外成熟培养36h、42h和48h,直径2－2.9mm卵泡卵的体外成熟率,体外受精后的卵裂率差异不显著（P＞0.05）。在体外成熟培养液中添加5％或15％的不同直径卵泡的卵泡液,各组间卵母细胞的体外成熟率,受精卵的体外发育率均无显著差异,结果表明：卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育有重要影响。     

颗粒细胞EGF类因子信号通路在调控卵母细胞成熟和发育中的作用

动物体内卵泡排卵前促黄体素(luteinizing hormone, LH)诱导了卵丘颗粒细胞扩散,并启动卵母细胞恢复减数分裂。普遍认为,卵泡壁层颗粒细胞表达LH受体,卵母细胞及其周围卵丘细胞不表达LH受体,LH通过作用于卵泡壁层颗粒细胞产生信号分子,这些信号分子作用于卵丘颗粒细胞介导了LH生物作用。然而,一直以来,关于排卵前介导LH作用而诱导卵母细胞成熟的机制一直存在争议。目前研究认为,LH作用于卵泡壁层颗粒细胞后产生了EGF类因子,并与颗粒细胞的受体结合,促进了卵母细胞的成熟和发育。由于体外成熟的卵丘卵母细胞复合体来源于生长卵泡,其卵丘颗粒细胞EGF类因子信号系统不完善,目前的体外成熟培养体系难以模拟卵泡内的生理环境,导致卵母细胞体外发育能力较差,限制了这些卵母细胞的利用效率。本文综述了颗粒细胞EGF类因子信号系统、EGF类因子在调控卵母细胞成熟中的作用及对卵母细胞发育能力的影响,为优化卵母细胞体外成熟培养体系,完善卵丘颗粒细胞的EGF类因子的信号系统,进而提高卵母细胞体外成熟效率提供理论依据。     

体外培养条件下促性腺激素对昆明白小鼠卵母细胞成熟及卵丘扩展的影响

研究促卵泡激素（FSH）,人绒毛膜促性腺激素（hCG)对昆明白小鼠卵母细胞成熟和卵丘扩展的影响,以及体外培养时卵丘扩展与卵母细胞成熟之间的关系,FSH可以明显促进次黄嘌吟（HX）抑制条件下的卵丘－卵母细胞复合体CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展,其最佳作用剂量为100IU／L,且FSH作用30分钟即可以使CEO获得恢复减数分裂的信息,在HX存在的条件下,FSH处理后10hr,CEO卵丘明显扩展,而生发泡破裂（GVBD）则在16－20hr明显增加,所有卵丘未扩展的CEO中卵母细胞均未发生GVBD,低剂量hCG单独或与FSH共同存在,对CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展均无明显影响;高剂量hCG可以部分抑制FSH对卵母细胞成熟的促进作用,结果表明：FSH明显促进CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展,而hCG却不具有此作用,体外培养条件下（含次黄嘌呤）,卵丘扩展是卵母细胞成熟的前提条件,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展。     

小鼠精子注入兔卵母细胞受精研究

利用显微操作仪将小鼠精子注入家兔卵母细胞的胞质内和透明带下,对鼠兔异种精卵互作和异种受精胚胎的发育进行了研究,并对注射精子的数量及卵的体外成熟时间等影响鼠兔异种显微受精的因素进行了探讨,结果如下:(1)将小鼠精子分别注入兔卵胞质内和透明带下,均能激活兔卵母细胞,导致精核解聚和原核形成;(2)小鼠精子注入兔卵胞质内和透明带下受精,杂种胚胎体外培养能发育到8-细胞期;(3)鼠兔异种受精4-细胞胚胎染色体标本制备观察结果表明,它们为正常二倍体;(4)鼠兔异种受精4-细胞胚胎的超微结构观察结果表明,它们极近似兔正常4-细胞胚胎的超微结构;(5)将小鼠精子注入兔卵透明带下,注射5—10个精子组卵的受精率(32.4%)和卵裂率(16.2%)均高于注射单个精子组的,但二组间差异不显著(P>0.05);DM 15%NCS液中体外成熟培养11—12h兔卵透明带下注入1—2个小鼠精子后的受精率(42.3%)和卵裂率(30.8%)均高于体外成熟培养24—25h组的,但二组间差异未达到显著水平(P>0.05)。     

绵羊卵母细胞体外核成熟和抑制及其对胚胎发育潜力的影响

本研究旨在探讨次黄嘌呤＋dbcAMP或IBMX＋dbcAMP对绵羊卵母细胞体外成熟的可逆性抑制作用,以及这种抑制作用对卵母细胞胚胎发育潜力的影响。自绵羊卵巢分离卵丘－卵母细胞复合物进行体外培养,培养基中分别加入或不加入上述抑制剂。培养6h后各组取部分卵母细胞固定染色检查卵母细胞核成熟情况;将其余的卵母细胞分别移入无抑制剂的成熟培养基中继续培养18h后,再次检查各组卵母细胞核成熟情况,并进行体外受精和胚胎培养。结果表明,次黄嘌呤＋dbcAMP或IBMS＋dbcAM都分别能使60％以上的绵羊卵母细胞抑制在GV期。这种抑制是可行性的,去除抑制剂后卵母细胞能恢复减数分裂,并加快由GVBD到MⅡ的成熟过程。各处理组肥精率,卵裂率和囊胚发育率与对照组相比无显著性差异,表明卵母细胞的胚胎发育潜力没有受损。上述物质对卵母细胞成熟的可逆性抑制可用于研究卵母细胞成熟及其胚胎发育潜力的调节机制。     

绵羊卵母细胞体外核成熟抑制及其对胚胎发育潜力的影响

本研究旨在探讨次黄嘌呤 +dbcAMP或IBMX +dbcAMP对绵羊卵母细胞体外成熟的可逆性抑制作用 ,以及这种抑制作用对卵母细胞胚胎发育潜力的影响。自绵羊卵巢分离卵丘 -卵母细胞复合物进行体外培养 ,培养基中分别加入或不加入上述抑制剂。培养 6h后各组取部分卵母细胞固定染色检查卵母细胞核成熟情况 ;将其余的卵母细胞分别移入无抑制剂的成熟培养基中继续培养 18h后 ,再次检查各组卵母细胞核成熟情况 ,并进行体外受精和胚胎培养。结果表明 :次黄嘌呤 +dbcAMP或IBMX +dbcAM都分别能使 6 0 %以上的绵羊卵母细胞抑制在GV期。这种抑制是可逆性的 ,去除抑制剂后卵母细胞能恢复减数分裂 ,并加快由GVBD到MⅡ的成熟过程。各处理组受精率、卵裂率和囊胚发育率与对照组相比无显著性差异 ,表明卵母细胞的胚胎发育潜力没有受损。上述物质对卵母细胞成熟的可逆性抑制可用于研究卵母细胞成熟及其胚胎发育潜力的调节机制。     

原癌基因c-myb在体外孕酮诱导小鼠卵母细胞成熟中的作用

目的：本文采用体外培养技术观察原癌基因c-myb对孕酮诱导的生发泡（GV）期小鼠裸卵体外成熟的影响。方法：建立小鼠裸卵体外培养模型,用不同浓度反义C-myb寡脱氧核苷酸（c-myb ASODNs）与GV期小鼠裸卵共孵育观察其对孕酮诱导的小鼠裸卵体外成熟的影响并探讨其机制。结果：在M199培养液中体外培养GV期小鼠裸卵24h,10μmol／L孕酮组与5μmol／L孕酮组比较有显著性差别（2 h GVBD％ P〈0.05,8 h PBI％ P〈0.05）．与20μmol／L孕酮组比较无显著性差别。10μmol／L c-myb AFODNs能抑制孕酮（10μmol／L）诱导的小鼠裸卵体外成熟（2 h GVBD％ P〈0.05,8 h PBI％ P〈0.01）。1×10^-4μmol／L dbcAMP、10μg／ml肝素钠可分别单独抑制孕酮诱导的GV期小鼠卵母细胞体外成熟（2 h GVBD％均P〈0.01,8 h PBI％均P〈0.01）．也可和反义c-myb ODN协同抑制孕酮诱导的卵母细胞体外成熟（2 h GVBD％均P〈0.01,8 h PBI％均P〈0.01）。结论：孕酮、原癌基因c-myb和cAMP、Ca^2＋参与了GV期小鼠卵母细胞的体外成熟,孕酮、cAMP和Ca^2＋调控卵母细胞成熟的机理可能与原癌基因c-myb表达有关。     

新生小鼠卵巢组织的玻璃化冻存、移植及分离卵泡的体外成熟培养初步研究

目的:系统地探索新生小鼠卵巢组织的玻璃化冻存建立卵巢库,移植和分离卵泡以及体外成熟培养的实验方法。方法:对1日龄小鼠卵巢组织进行冻存,解冻复苏和同种肾包膜下移植,从卵巢移植物种中进行卵泡分离和体外成熟培养。结果:①采用平衡液(ES)处理25min,玻璃化液(VS)处理3min方案冻存的卵巢组织具有更高比例的形态完整卵泡,其完整原始卵泡率均值达96.6%,显著性高于实验中其它四组方案(P0.05);②在分别移植2周和4周后回收卵巢移植物,发现二者的卵巢回收率无显著差异(P0.05),但移植4周组的卵泡回收数目要明显高于2周组(P0.05);③在培养基中添加适量的自体血清(10%,V/V)能显著提高卵子的体外成熟率,培养12h后对照组中生发泡破裂(GVBD)发生率为(34.74±4.26)%,添加血清后提高至(54.60±3.37)%,成熟的MⅡ期卵子获得率从(43.17±1.31)%升高至(57.75±5.31)%,有显著性差异(P0.05)。结论:通过该实验较好地建立了卵巢组织的玻璃化冻存、移植和卵泡分离以及体外成熟培养的实验方法。