In vitro Oocyte Maturation in the Zebrafish Brachydanio rerio and Fertilization and Development of the Mature Egg

Maturation process of zebrafish oocyte was investigated using in vitro incubation.In medium EM-199 containing 0.5 μg/ml of 17α-hydroxyprogesterone incubated under 80％ O_2 and at 25°C,germinal vesicles(GV)of oocytes in stage Ⅳ migrated from midway between the center and theperiphery ofoocytes to the periphery in 40 minutes and the oocytes went into stage V.Half an hourlater,the oocytes underwent germinel vesicle breakdown(GVBD)with a breakdown rate of 59％.Two more hours were needed for such oocytes to complete their final maturation.The mature eggscould not come off from the follicle layer surrounding them by themselves(ovulation).By removingthe follicle and adding active sperms for insemination,we could make the mature eggs fertilized.Thechorion was elevated and blastoderm formed on the animal pole.The cleavage and development ofthese fertilized eggs followed the same course as the naturally matured and fertilized eggs.Usingblastula formation as a marker of successful fertilization of the in vitro matured egg,the fertilizationrate was 78％.This is the first report on the successful in vitro incubation of mature oocytes inzebrafish.The establishment of this in vitro oocyte maturation technology has laid the foundationfor further investigation of the transfer of foreign genes in the germinal vesicles of oocytes.     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着ｍＲＮＡ不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体ｍＲＮＡ的控制。当这些ｍＲＮＡ在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的ｍＲＮＡ。ｍＲＮＡ这种有规律的代谢活动控制着细胞的分化、胚层的形成以及模式形成（ｐａｔｅｒｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。所有这些ｍＲＮＡ水平上的变化都可以用ｍＲＮＡ差异显示法（ｍＲＮＡｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ）检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。ｍＲＮＡ差异显示法是由Ｌｉａｎｇ和Ｐａｒｄｅｅ于１９９２年建立起来的,用于显示两种不同组织之间ｍＲＮＡ差异的方法。基于绝大多数ｍＲＮＡ有一个ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴,选用一个较特殊的３’端引物─５’Ｔ１１ＭＮ３’,其中Ｍ可以是ｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ之一,而Ｎ可以是ｄＡＴＰ,ｄＴＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ之一,进行逆转录时,１／１２的ｍＲＮＡ可被逆转录为ｃＤＮＡ。这种ｃＤＮＡ第一链被用来ＰＣＲ扩增,所使用的３’端引物与逆转录引物相同,而５’端引物为１０个碱基的一段寡核苷酸,这类任意（ａｒｂｉｔｒａｒ     

斑马鱼—发育生物学研究的最佳脊椎动物模型

从八十年代初开始的、通过突变体分离早期胚胎发育基因的研究,揭示了无脊椎动物果蝇形态发生的分子机制,成为1995年诺贝尔生理或医学奖的主要内容,同时也标着发育生物学已经成为生物学的带头学科。该成果的取得得益于果蝇具备发育生物学研究模型的特点,即可同时进行胚胎学和发育遗传学研究。在脊动物发育生物学研究方面,由于缺少适当的研究模型,有关早期胚胎发育基因表达调鬼斧神工的研究始终未获突破性进展。包括小鼠、鸡、爪蟾等在一些脊椎动物都只适用于胚胎学或者遗传学某一学科的研究,均不是理想的发育生物学研究模型。一种小型的鲤科鱼－斑马鱼,逐渐成为发育生物学研究的最佳脊椎运动模型。它光周期产卵、卵大,胚胎在体外发育,胚胎发育速度快,早期胚胎完全透明,这些特点使它成为很好的脊椎动物胚胎学研究模型;同时,它个体小,产卵量大,产卵周期短,单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易,精子可以冷冻保存,所有这些特点又使斑马鱼非常适合于发育遗传学研究。本文将详细论述斑马鱼作为脊椎动物发育生物学研究模型的特点,以及作为模型动物正在进行的有关工作。     

Electrofusion between Blastula Cells and Unfertilized Egg in Loach (Paramisgurnus dabryanus)

Electrofusion between blastula cells and unfertilized eggs in loach were investigated usingdielectrophoretic field where, under alternating sinusoidal electric field, blastula cells formed beads-like chain in close contact with the unfertilized egg and cell fusion occurred between eggs and thecells in tight contact with them. The nuclei ofblastula cells were brought into the cytoplasm of therecipient eggs, where they promoted the development of the fused eggs just like the zygote nuclei.But the development of the fused eggs was different from that of zygotes. Several nuclei might enterone and the same egg simultaneously and all of them could undergo division, resulting in severalblastomere after the first cleavage of the recipient egg. Before blastula stage, the embryo developingfrom the fused egg showcd irregular shape, but it was soon regulated and developed to a normalblastula which often continued its development into a normal individual. Cell/egg electrofusion cameto its highest fosion rate (80%) 8nd hatching rate (20%), with cell density at 1×10~3 cells/ml, Ca~(++)concentration at 10 mM, mannitol at 0.2 M and when the blastula cells were digested with 100μg/ml pronase E for 6-10 min at 20℃. The mechanism underlying development of electrofused eggsis discussed. As the result indicates, electrofusion might prove to be a promising biotechnology justas nuclear transplantation.     

鼠精子发生时期差异表达基因的克隆(英文)

为了分离鼠精子发生时期表达的基因,本文采用mRNA差异显示法,以鼠的粗线期卵母细胞为对照,检测了出生后60天和16天鼠的睾丸。得到12个有差异的片段(Fig.1&Table 1)。克隆测序结果表明,其中5个与已知基因非常吻合,另外6个与一些未知功能的cDNA、ESTs有较高的同源性,只有1个与已知序列没有同源性。Northern杂交分析显示sp1和sp8主要在成年鼠睾丸表达(Fig.4B)。采用5RACE对sp1的cDNA进行了全长分析,该基因编码一个推测是高度磷酸化蛋白的541个氨基酸(Fig.2),其中包括一个核定位信号,无论在核苷酸水平上,还是在氨基酸水平上均没有明显的同源性,仅在2个蛋白区有少量同源氨基酸(Fig.3)。该基因在20-60天龄鼠的睾丸均有表达,并且具有很高的组织特异性只在睾丸里表达(Fig.4A)。因而,这个基因有可能参与减数分裂及其以后的整个过程。可以认为这是一个新基因。我们把它命名为peat (predominantly expressed in adult testis)。     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着mRNA不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体mRNA的控制。当这些mRNA在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新的基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的mRNA。mRNA这各肯规律的代谢活动控制着细胞的分化、层的形成以及模式形成（pattem formation)。所有这些mRNA水平上的变化都可以用mRNA差异显示法（mRNA differential displsay)检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。mRNA差异显示法是由Liang和Psardee于1992年建立起来的,用于显示两种不同组织之间mRNA差异的方法。基于绝大多数mRNA有一个poly(A)尾巴,选用一个较特殊的3’端引物－5’T11MN3’,其中M可以是dATP,dCTP,dGTP之一,而N可以是dATP,dTTP,dGTP之一,进行逆转录时,1／12的RNA可被逆转录为cDNA。这种cDNA第一链被用来PCR扩增,所使用的3’端引物与逆转录引物相同,而5’端引物为10个碱基的一个寡核苷酸,这类任意（aritrary)引物共有26种。这样,当我们利用一对引物进行RT－PCR时,1／312（12X26＝312）的mRNA可以被显示出来。将来自不同发育阶段胚胎的总RNA的RT－PCR产物在6％的聚丙烯酰胺变性胶上平等走电泳、放射自显影后即可知道胚胎之间在mRNA水平上的差别,然后从cDNA文库中钓取全长的cDNA或从基因文库中筛选完整基因并对其序列、结构、功能等方面进行研究,从而揭示不同发育阶段胚胎间性状上差异的根源。mRNA差异显示技术已在小鼠、大鼠、斑巴鱼、抓蟾等动物的早期胚胎发育基因的研究中得了应用,取得了较好的结果。     

Zebrafish as the Best Vertebrate Model for Development Studies

从八十年代初开始的、通过突变体分离早期胚胎发育基因的研究,揭示了无脊椎动物果蝇形态发生的分子机制,成为１９９５年诺贝尔生理或医学奖的主要内容,同时也标志着发育生物学已经成为生物学的带头学科。该成果的取得得益于果蝇具备发育生物学研究模型的特点,即可同时进行胚胎学和发育遗传学研究。在脊椎动物发育生物学研究方面,由于缺少适当的研究模型,有关早期胚胎发育基因表达调控的研究始终未获突破性进展。包括小鼠、鸡、爪蟾等在内的一些脊椎动物都只适用于胚胎学或者遗传学某一学科的研究,均不是理想的发育生物学研究模型。一种小型的鲤科鱼———斑马鱼,逐渐成为发育生物学研究的最佳脊椎动物模型。它光周期产卵,卵大,胚胎在体外发育,胚胎发育速度快,早期胚胎完全透明,这些特点使它成为很好的脊椎动物胚胎学研究模型;同时,它个体小,产卵量大,产卵周期短,单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易,精子可以冷冻保存,所有这些特点又使斑马鱼非常适合于发育遗传学研究。本文将详细论述斑马鱼作为脊椎动物发育生物学研究模型的特点,以及作为模型动物正在进行的有关工作。     

斑马鱼卵母细胞的体外成熟及成熟卵的受精发育

采用体外培养的方法,研究斑马鱼卵母细胞的成熟过程。Ⅳ时相初级卵母细胞在o．5μg／m1 17a－羟基孕酮的EM－199培养液中,80％氧气,25℃的体外培养条件下,在40min内,胚泡(GV)逐渐由卵母细胞中央至动物极边缘l／2处移到动物极边缘,进八V时相卵母细胞。30min后胚泡破裂(GVBD),胚泡破裂率为59％。此种卵母细胞继续培养2h才完全成熟。成熟卵不能从滤泡膜中自然排出。冷开水中剥离其外边的滤泡膜后加入具有受精能力的精子,即能使成熟卵受精,受精膜举起,胚盘在动物极形成。其后受精卵的分裂、发育等与自然成熟受精卵相同。以发育至囊胚为受精标准,这种体外成熟卵受精率为78％。这是斑马鱼卵母细胞体外培养成熟的首例报道。鱼类卵母细胞体外成熟技术的建立,为外源基因卵母细胞胚泡内转移奠定了基础。