卵丘在卵母细胞成熟中的作用

卵丘是指在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群;卵丘对于卵母细胞成熟有极其重要的作用。主要表现在卵丘参与维持卵母细胞减数分裂阻滞,诱导卵母细胞减数分裂恢复、支持卵母细胞细胞质的成熟。卵丘形态和卵丘扩展影响卵母细胞成熟。了解卵丘在卵母细胞成熟中的作用有助于帮助人们进一步揭示哺乳动物卵母细胞成熟的机制。     

体外培养条件下促性腺激素对昆明白小鼠卵母细胞成熟及卵丘扩展的影响

研究促卵泡激素（FSH）,人绒毛膜促性腺激素（hCG)对昆明白小鼠卵母细胞成熟和卵丘扩展的影响,以及体外培养时卵丘扩展与卵母细胞成熟之间的关系,FSH可以明显促进次黄嘌吟（HX）抑制条件下的卵丘－卵母细胞复合体CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展,其最佳作用剂量为100IU／L,且FSH作用30分钟即可以使CEO获得恢复减数分裂的信息,在HX存在的条件下,FSH处理后10hr,CEO卵丘明显扩展,而生发泡破裂（GVBD）则在16－20hr明显增加,所有卵丘未扩展的CEO中卵母细胞均未发生GVBD,低剂量hCG单独或与FSH共同存在,对CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展均无明显影响;高剂量hCG可以部分抑制FSH对卵母细胞成熟的促进作用,结果表明：FSH明显促进CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展,而hCG却不具有此作用,体外培养条件下（含次黄嘌呤）,卵丘扩展是卵母细胞成熟的前提条件,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展。     

小鼠卵母细胞体外成熟不同阶段对钙的依赖性

To determine the role of calcium and calmodulin in mouse oocyte maturation, we examined the distribution of intracellular calcium during mouse oocyte maturation by using Mira Cal Imaging System. The calcium was present homogeneously in oocytes with intact germinal vesicle (GV) and accumulated around the nuclear region after GV breakdown(GVBD). The high level of calcium disappeared 6 hours later after GVBD. In the presence of 50 mumol/L BAPTA/AM, we failed to observe this phenomena. All eggs treated with 20 mumol/L W7, an antagonist of calmodulin, 50 mumol/L BAPTA/AM, a calcium chelator, could not develop to metaphase II (MII), although GVBD was not affected. We also detected the activity of a cytoplasmic maturation-promoting factor (MPF). W7 and BAPTA/AM had no effects on the rise of MPF activity in the course of maturation. We suggest that compartment distribution of calcium around nuclear region plays an important role in mouse oocyte maturation.     

蛋白质合成抑制剂亚胺环已酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究了蛋白质合成抑制剂亚胺环已酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟过程中的GVBD、染色质凝集、MⅡ期成熟及卵丘细胞扩展的作用。结果表明：（1）培养液中添加CHX,可抑制卵母细胞GVBD的发生,而且此作用是浓度依赖性的,但CHX的抑效果是完全可逆的;（2）在含10μg/mlCHX液中分别培养0、6、12和24h后转入正常培养液再继续培养至48h,卵母细胞成熟率分别为84．1％、77．1％、48．9％和27．8％;（3）正常培养液中培养0、6、12、24、36和48h后,再转入浓度为10μg/mlCHX液中继续培养至48h,卵母细胞成熟率分别为0、0、0、31．3％、65．4％和79．5％;（4）CHX对卵丘细胞扩展的影响培养时间延长而增强,在CHX中处理时间为16h或更长,完全抑制卵丘细胞的扩展。     

雌二醇和孕酮对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的研究雌二醇（E2）、孕酮（P4）对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法小鼠经注射孕马血清促性腺激素（PMSG）后48 h,摘取卵巢获得未成熟卵母细胞,分别在单独含不同浓度的E2或P4的成熟液中,或在同时含有不同浓度E2和P4的成熟液中,进行体外成熟,并对经过E2和P4处理成熟的卵母细胞进行体外受精。结果经15-16 h的成熟培养,各E2处理组的卵母细胞第一极体排出率虽然均略高于对照组,但它们之间无显著差异;各组卵母细胞体外受精48 h后,1000 ng/mL E2处理组的卵裂率显著低于其他各处理组和对照组,但各组的囊胚率之间无显著差异。各P4处理组的极体率和卵裂率,与对照组相比无显著差异,但是各处理组的囊胚率均极显著低于与对照组;两种激素协同处理组中[1000 ng/mL E2＋1000 ng/mL P4]组的极体率显著高于其他各处理组;而与对照组的极体率差异不显著。结论P4对小鼠卵母细胞的后期发育能力有一定的抑制作用,而E2却对小鼠卵母细胞的成熟及其发育潜力无明显作用。     

斑马鱼卵母细胞的体外成熟及成熟卵的受精发育

采用体外培养的方法,研究斑马鱼卵母细胞的成熟过程。Ⅳ时相初级卵母细胞在o．5μg／m1 17a－羟基孕酮的EM－199培养液中,80％氧气,25℃的体外培养条件下,在40min内,胚泡(GV)逐渐由卵母细胞中央至动物极边缘l／2处移到动物极边缘,进八V时相卵母细胞。30min后胚泡破裂(GVBD),胚泡破裂率为59％。此种卵母细胞继续培养2h才完全成熟。成熟卵不能从滤泡膜中自然排出。冷开水中剥离其外边的滤泡膜后加入具有受精能力的精子,即能使成熟卵受精,受精膜举起,胚盘在动物极形成。其后受精卵的分裂、发育等与自然成熟受精卵相同。以发育至囊胚为受精标准,这种体外成熟卵受精率为78％。这是斑马鱼卵母细胞体外培养成熟的首例报道。鱼类卵母细胞体外成熟技术的建立,为外源基因卵母细胞胚泡内转移奠定了基础。     

蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究了蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮 (CHX)对猪卵母细胞体外成熟过程中的GVBD、染色质凝集、MⅡ期成熟及卵丘细胞扩展的作用。结果表明 :( 1)培养液中添加CHX ,可抑制卵母细胞GVBD的发生 ,而且此作用是浓度依赖性的 ,但CHX的抑制效果是完全可逆的 ;( 2 )在含 10 μg/mlCHX液中分别培养 0、 6、 12和 2 4h后转入正常培养液再继续培养至 4 8h ,卵母细胞成熟率分别为 84 1%、 77 1%、 4 8 9%和 2 7 8% ;( 3 )正常培养液中培养 0、 6、 12、 2 4、 3 6和 4 8h后 ,再转入浓度为 10 μg/mlCHX液中继续培养至 4 8h ,卵母细胞成熟率分别为 0、 0、 0、 3 1 3 %、 65 4 %和 79 5 % ;( 4 )CHX对卵丘细胞扩展的影响随培养时间延长而增强 ,在CHX中处理时间为 16h或更长 ,完全抑制卵丘细胞的扩展     

内源环化腺苷酸(cAMP)含量变化对卵母细胞成熟的影响

孕酮处理前,冬眠卵内源cAMP平均水平为500 Fmol.左右;处理后cAMP迅速下降,在12小时内下降59%,卵的生殖泡破裂。高温卵或热休克冬眠卵,孕酮刺激后cAMP水平亦下降,生殖泡却未破裂,但在高温卵质中出现依赖“冬眠因子”的促成熟活性物质,而在热休克冬眠卵质中出现不依赖“冬眠因子”的促成熟活性物质。热休克能影响卵的生殖泡破裂,却未影响卵质中MPF的形成。孕酮刺激后引起的卵内cAMP含量下降,只能是卵母细胞成熟的必要条件,而不是唯一的条件。     

蛋白激酶C在小鼠卵母细胞体外成熟和受精中的作用

蛋白激酶是一类重要的丝/苏氨酸蛋白激酶。本实验以小鼠为实验动物,研究了PKC在卵母细胞体外成熟、活化和受精中的可能作用,及两种PKC亚型在卵母细胞中的定位。PKC激活剂PMA可以阻止CV期卵母细胞在体外恢复减数分裂,该作用可被PKC抑制剂calphostin C抵消,但不能被PLCγ抑制剂U73122或PKCδ专一性抑制剂Rottlerin所克服。Western印迹显示PKCα和βⅠ在卵母细胞发育过程中恒量表达。激光共聚焦显微术研究发现,受精或受到活化刺激后PKCα转位到卵母细胞膜上,同时皮质颗粒排放,说明PKCα可能参与调节卵皮质反应。本实验首次在小鼠中研究了PLCγ与受精的关系,发现不存在PKC对PLCγ的正反馈调节。此外,本研究还对小鼠卵巢中对PKCα和βⅠ进行了蛋白定位研究。     

小鼠卵母细胞体外成熟不同阶段对钙的依赖性

本研究旨在探讨小鼠卵母细胞成熟与钙和钙调素的关系。研究发现,20μmol/L W7、50μM BAPTA/AM对GVBD发生没有影响,但阻断了中期Ⅰ的卵母细胞进入中期Ⅱ。通过测定成熟不同阶段细胞内钙的分布,发现GVBD后染色体周围区域有较高水平的钙分布,并且该现象能被加BAPTA/AM而消除。GVBD发生后6h左右高钙分布现象消失。我们还测定了成熟过程中MPF活性的变化,20μmol/L W7、50μmol/L BAPTA/AM对卵母细胞成熟过程中MPF活性的升高没有影响。结果表明:小鼠卵母细胞GVBD的发生不依赖钙和钙调素;钙和钙调素对中期Ⅰ的发育是必需的,并且核周区钙分布可能起着重要作用。     

小鼠卵母细胞成熟和受精过程中Ca^2＋分布变化的研究

用焦锑酸钾原位定位法、膜结合Ｃａ＾２＋荧光探针金霉素标记法,分别在电镜和光镜水平对小鼠卵成熟和卵受精过程中结合态Ｃａ＾２＋的分布及其变化进行了研究,发现：１）Ｃａ＾２＋分布于线粒体、胞质、内质网囊泡、微绒毛和透明带等部位,其中以线粒体基质中分布密度为最大;２）减数分裂Ｉ中、后期于纺锤体极区结合有较多的Ｃａ＾２＋;３）生发泡、纺锤体和原核内膜结合态Ｃａ＾２＋含量很少,但纺锤体和原核周围分布较多;４）     

卵龄和脉冲持续时间对小鼠卵母细胞电活化效果的影响

实验研究了相同电场强度，一次脉冲条件下，不同脉冲持续时间和不同卵龄对小鼠卵母细胞电活化效果的影响，结果说明：（１）在场强０．４５ＫＶ／ｃｍ，一次脉冲持续时间为１０、２０和４０μｓ时，卵母细胞活化率很低，仅为９．８％，５．５％和１２％，当脉冲持续８０、１６０、３２０、６４０和２８０μｓ时，活化率明显升高，分别为３６．５％、５３．３％，５９．７％，５１．２％和３９．４％，脉冲持续时间对卵线细胞碎裂率影     

微血管内皮细胞的分离、纯化、鉴定及基因转移的研究

用胶原酶消化,梯度离心,LDL-FACS法分离及纯化小鼠肺组织微血管内皮细胞(MLMEC),并根据细胞形态及间接免疫荧光法加以鉴定。纯化后的MLMEC形态为多边形、短梭形,呈鹅卵石样排列;它能摄取RB-DiL-Ac-LDL,从而胞浆内出现亮红色颗粒;用抗PECAM抗体间接免疫荧光染色后细胞接触处呈亮绿色,细胞轮廓清晰可见。用感染法将HSV-TK基因转入MLMEC细胞内,用XTT法显示携带有HSV-TK基因的MLMEC/TK化及基因转移方法的建立将为研究MLMEC在各种病理状况下的作用及作为基因治疗的载体提供体外模型。     

应用氯化锶和放线菌酮对小鼠卵母细胞进行孤雌活化的研究

本试验研究了SrCl_2浓度和作用时间,以及卵龄和蛋白合成抑制剂放线菌酮等对昆明种小鼠卵母细胞活化的影响。研究表明,以含1.6mmol/L SrCl_2的无钙M16液对小鼠卵母细胞活化效果最好(87.0％),显著(P<0.05)优于SrCl_2浓度为1.0、5.0、10.0mmol/L的同种液体。SrCl_2作用时间10分钟显著(P<0.05)好于5、20、30或60分钟。注射hCG后18和20小时卵母细胞的活化率(分别为87.0％和84.6％)显著(P<0.01)高于14或16小时的活化率(分别为4.8％和16.5％)。CHX与SrCl_2联合使用产生显著的协同促进卵母细胞活化作用。     

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。本实     

6-DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入2 mmol/L 6-DMAP可抑制卵母细胞自发的染色质浓缩和生发泡破裂(GVBD)。源自超排的MⅡ期卵母细胞则能为6-DMAP所激活。hCG注射后18—19h的卵母细胞置于2 mmol/L6-DMAP的CZB溶液中培养0.5 h、1h、2h、3h,卵母细胞的激活率分别为26.1%、75.2%、75.8%、77.3%、;卵裂率分别为88.2%、73.2%、67.0%、58.4%。与乙醇激活法相比,6-DMAP处理引起了不同的孤雌激活类型。     

环境温度影响蟾蜍卵母细胞成熟能力的机制之实验分析

长年饲养在高温(28—30℃)环境中雌性中华大蟾蜍,它们的卵母细胞可以长足,但经激素处理时,生发泡不破裂,仅显示成熟过程早期阶段的变化。值得注意的是,在孕酮刺激后的高温卵卵质中,出观了一种能诱发低温卵恢复减数分裂的物质,称作为“依赖冬眠因子的促成熟物质”(HF-MPS)。HF-MPS 与MPF 有不少相似之处,如孕酮处理后,它们在卵质中出现的时间相仿,它们的形成均不依赖于转录水平,而是依赖于翻译水平的蛋白质合成活动;但亦存在不同之处,如MPF 诱发低温卵GVBD 时程不受温度影响,而HF-MPS 在10℃环境中,诱发低温卵GVBD 的时间明显延缓;MPF 不仅能诱发低温卵GVBD,而且同样能诱发高温卵GVBD,然而,HF-MPS 只能诱发低温卵GVBD。由此表明,MPF 和HF-MPS 似乎是截然不同的两类活性蛋白质。高温卵缺少低温诱发产生的“冬眠因子”,所以不能恢复cdc 2基因的转录活动,不能实现MPF 自身催化扩增作用,不能保证孕酮处理后的卵母细胞完成正常成熟的全过程变化。足见,低温是中华大蟾蜍卵母细胞恢复减数分裂过程中的必要条件,是导致中华大蟾蜍现有区域分布的内在原因之一。