雄激素含量测定用蛋白微阵列的制备

利用分子生物学技术对鼠雄激素受体结合域(rARLBD)重组表达,结合新兴的蛋白质微阵列技术建立了一种快速无污染的检测方法,用于临床雄激素检测及新药发现。实验将编码ARLBD的cDNA片段(888bp)插入到含有多聚组氨酸标签的表达载体pET32a中构建了表达质粒pET32a/AR,并将其转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG低温诱导,得到高效表达的可溶性ARLBD融合蛋白产物,并通过NiNTA凝胶亲和吸附纯化。将纯化得到的ARLBD使用芯片点样仪固定到硅烷化-多糖表面片基,制备得到ARLBD蛋白质微阵列。实验得到的特异性结合曲线表明在微阵列上的受体蛋白能够保持功能构像。通过Scatchard方程计算得到微阵列上ARLBD与荧光标记的睾酮结合的Kd值为5.32nmol/L。浓度依赖性标准曲线表明这一方法有较高的灵敏度,最低检测限达1pmol/L。应用这一方法对224例健康中国老年人血清雄激素水平进行了测定,研究证明了该方法的可靠性,并首次提供了一定样本量的我国老年人血清活性雄激素水平的参考值。这一技术的建立将为生物工程技术产品与临床检测和分子水平化合物筛选有效地结合提供一条新的途径。     

镉对中国林蛙变态和性腺分化的影响

将发育到26—27期的中国林蛙（Rana chensinensis）共200例蝌蚪分别暴露在0.05、0.1、0.2和0.4 mg/L Cd²⁺的水体中直至完全变态。解剖完全变态后的幼蛙,观察其性腺分辨性别,统计雌性比率。用免疫组织化学方法检测雌激素受体（estrogen receptors,ER）在肝细胞的表达定位。结果显示：①Cd²⁺诱导蝌蚪变态时出现肢体畸形,但畸形率与Cd²⁺处理浓度相关性较低,0.4 mg/L Cd²⁺组肢体畸形率较高。②Cd²⁺影响林蛙幼体的性腺分化。与对照组相比,0.05 mg/L Cd²⁺组的雌性比率明显增大,0.1、0.2和0.4 mg/L Cd²⁺组的雌性比率相对降低,其中0.2 mg/L Cd²⁺组差异显著。在0.2和0.4 mg/L Cd²⁺组中出现个别雌雄同体。 ③ER在Cd²⁺处理组的肝细胞质和细胞核中均有阳性表达,但ER的表达量与Cd²⁺浓度不呈现线性相关。以上结果表明,Cd²⁺可能通过干扰性激素的分泌而影响蝌蚪变态和性腺发育。     

血红素加氧酶-1可能经诱导 foxp3+CD4 +CD25 + Treg细胞抑制哮喘气道炎症

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)作为体内保护蛋白, 在哮喘气道炎症中具有显著的抗炎作用. foxp3+CD4 ⁺CD25 ⁺ T调节细胞(T regulatory cells, Treg)是调节性细胞的主要组成部分, 以抑制的方式调控其他效应细胞的活性和功能. IL-10是多种细胞分泌的抗炎细胞因子, 具有免疫抑制功能. 本研究探讨HO-1诱导foxp3 ⁺CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 增加IL-10分泌以拮抗哮喘气道炎症. 选用磁珠分离CD4⁺CD25⁺ Treg, 含 HO-1 质粒转染或血红素(Hemin)和锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin, SnPP)处理, RT-PCR和Western blot方法检测显示Hemin上调HO-1表达, CD4⁺CD25⁺ Tregfoxp3 表达及蛋白水平显著增加, ELISA方法测定上清液IL-10水平明显升高. 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏、激发的哮喘小鼠, Hemin上调HO-1表达, 肺和脾脏中foxp3表达及蛋白量亦增加, 血清IL-10增高, 而OVA特异性IgE水平降低. 肺病理组织学检测、支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid, BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)计数均显示炎性细胞尤其是EOS浸润减少; CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg功能抑制实验发现, OVA致敏、激发Balb/C小鼠经Hemin干预后, 抑制作用显著增加; SnPP能逆转HO-1作用. IL-10剔除的B6.129P2-Il10^tm1Cgn/J小鼠Treg抑制作用经Hemin干预后仍未改善. 但体内外实验发现TGF-β水平无变化. 本研究表明: HO-1可能经诱导CD4 ⁺CD25⁺ Treg 特异性转录因子foxp3表达, 激活CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 促进IL-10分泌, 以拮抗哮喘气道炎症.     

芦丁、槲皮素快速修复嘌呤脱氧核苷酸阳离子自由基

利用脉冲辐解技术研究了芦丁和槲皮素对嘌呤脱氧核苷酸阳离子自由基的修复作用. 脉冲辐照经N²饱和的含20 mmol/L K²S²O⁸, 200 mmol/L t-BuOH及芦丁或槲皮素的脱氧核苷酸中性水溶液, 几十个微秒内出现芦丁或槲皮素酚氧自由基的瞬态吸收谱, 同时先前形成的脱氧核苷酸阳离子自由基的瞬态吸收谱迅速衰减, 表明被试黄酮能够快速修复脱氧核苷酸阳离子自由基. 对dAMP和dGMP阳离子自由基的修复反应速率常数分别为(3.8 ~ 4.4)×10⁸和(1.3 ~ 1.8)× 10⁸ L/(mol·s).     

L型Ca2+通道自发激活对静息心肌细胞钙火花的影响

钙火花是心肌细胞肌浆网Ca²⁺释放的基本单位. 为了研究L型Ca²⁺通道自发开放对心肌细胞钙火花的影响, 实验使用激光共聚焦扫描显微镜和Ca²⁺荧光探针Fluo-4, 在大鼠心肌细胞上观察局部钙火花的发放. 结果表明, 0.2 mmol/L CdCl₂通过阻断L型Ca²⁺通道, 使自发性钙火花的发放频率从给药前的4.20下降到给药后的2.04个/(100 μm∙s), 但不影响火花的时空特性. 对Cd²⁺敏感的钙火花进行分析, 推测在静息膜电位下(−80 mV), L型Ca²⁺通道的开放概率约为10^−5. 因此, 在静息心肌细胞中, L型Ca²⁺通道低频随机开放对自发性钙火花的产生及细胞钙稳态调节有重要影响.     

HIV-1复合多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒疫苗的构建及小鼠免疫原性

将HIV-1 p24基因插入至人工设计的复合多表位基因MEG中, 获得嵌合基因MEGp24; 将MEGp24插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游, 构建出鸡痘病毒重组转移质粒; 经转染和BrdU加压筛选, 以基因组PCR和Western blot法筛选出重组病毒; 将重组病毒大量制备并纯化后, 分别于0, 14, 42天肌肉注射免疫BALB/c小鼠; 第3次免疫后一周, 采集小鼠全血与脾脏, 分离血清并无菌制备脾淋巴细胞, ELISA法检测小鼠血清HIV-1抗体、脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-α和IL-2的含量, 流式细胞仪测定CD4⁺, CD8⁺ T淋巴细胞亚类数量, 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性. 结果表明, 重组病毒刺激小鼠产生HIV-1特异性抗体, 出现T细胞亚类数量增加, 产生针对HIV-1 H-2^d限制性CTL表位的特异性靶细胞杀伤作用, 同时免疫小鼠脾细胞在HIV-1抗原肽的刺激下分泌Th1类细胞因子的水平大幅增加. 研究提示多表位嵌合基因重组FPV疫苗具有良好的免疫原性, 可诱导小鼠产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.     

甘草次酸与AT1受体结合的研究

运用受体放射配基结合法, 激光共聚焦显微镜技术, Northern blot, ³H-TdR掺入DNA等技术, 研究甘草次酸(glycyrrhetic acid, GA)与AT₁受体的结合以及此作用的可能机制. 研究表明, GA对血管平滑肌细胞(VSMC) AT₁受体有较好的结合作用(IC₅₀为35.0 μmol/L), 它能引起细胞内[Ca²⁺]_i增加, 激活转录因子c-myc, 从而产生对VSMC的增殖作用, 因此, GA具有AT₁受体激动剂样作用, 这一结果为中药甘草的药理作用提供一种新机制.     

孕酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外实验模型,分别添加10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10 mol/L孕酮,运用实时荧光定量PCR方法测定孕酮对上皮细胞内β-防御素相对表达量的影响。结果显示,与对照组比较,10^-6和10^-7 mol/L孕酮组β-防御素相对表达量显著升高（P<0.05）;10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著升高（P<0.01）;而10^-10 mol/L孕酮组未见显著性差异。孕酮添加组间比较显示,10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著高于10^-10 mol/L组（P<0.01）,其它孕酮添加组间未见显著性差异。分析认为,一定浓度的孕酮（10^-9－10^-6 mol/L）对培养的输卵管上皮细胞β-防御素的表达有促进作用。且不同浓度的孕酮对β-防御素表达的影响程度不同。因而推断,雌性生理周期下,雌性生殖道β-防御素的表达与孕激素相关。     

A comparison of nitrate transport in four different rice (Oryza sativa L.) cultivars

As rice can use both nitrate (NO₃^-) and ammonium (NH₄⁺), we have tested the hypothesis that the shift in the pattern of cultivars grown in Jiangsu Province reflects the ability of the plants to exploit NO₃^- as a nitrogen (N) source. Four rice cultivars were grown in solution culture for comparison of their growth on NO₃^- and NH₄⁺ nitrogen sources. All four types of rice, Xian You 63 (XY63), Yang Dao 6 (YD), Nong Keng 57 (NK) and Si You 917 (SY917), grew well and produced similar amounts of shoot biomass with 1 mmol/L NH₄⁺ as the only N source. However, the roots of NK were significantly smaller in comparison with the other cultivars. When supplied with 1 mmol/L NO₃^-, YD produced the greatest biomass; while NK achieved the lowest growth among the four cultivars. Electrophysiological measurements on root rhizodermal cells showed that the NO₃^--elicited changes in membrane potential (ΔE_m) of these four rice cultivars were significantly different when exposed to low external NO₃^- (<1 mmol/L); while they were very similar at high external NO₃^- (10 mmol/L). The root cell membrane potentials of YD and XY63 were more responsive to low external NO₃^- than those of NK and SY917. The ΔE_m values for YD and XY63 rhizodermal cells were almost the same at both 0.1 mmol/L and 1 mmol/L NO₃^-; while for the NK and SY917 the values became larger as the external NO₃^- increased. For YD cultivar, ΔE_m was measured over a range of NO₃^- concentrations and a Michaelis-Menten fit to the data gave a K_m value of 0.17 mmol/L. Net NO₃^- uptake depletion kinetics were also compared and for some cultivars (YD and XY63) a single-phase uptake system with first order kinetics best fitted the data; while other cultivars (ND and SY917) showed a better fit to two uptake systems. These uptake systems had two affinity ranges: one had a similar K_m in all the cultivars (0.2 mmol/L); the other much higher affinity system (0.03 mmol/L) was only present in NK and SY917. The expression pattern of twelve different NO₃^- transporter genes was tested using specific primers, but only OsNRT1.1 and OsNRT2.1 expression could be detected showing significant differences between the four rice cultivars. The results from both the physiological and molecular experiments do provide some support for the hypothesis that the more popular rice cultivars grown in Jiangsu Province may be better at using NO₃^- as an N source.     

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量

观察p18^INK4C (p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18^-/-)纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18^+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18^-/-细胞与p18^+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

醌类光敏剂HA, HB与纳米半导体CdS间的光生电子传递——HA-CdS, HB-CdS复合体光敏还原动力学的EPR研究

根据非均相体系电子传递动力μ =E_s*/s+-E_CB(μ＜0)的原理,构建出相匹配的HA-CdS和HB-CdS复合体(以下简称Hys-CdS,Hys代表HA,HB).在该体系中,¹Hys*向CdS导带传递电子是热力学允许的.通过荧光淬灭实验,测出它们之间的表观结合常数(K_app )分别为940 (mol/L)^-1(HA-CdS),934(mol/L)^-1(HB-CdS),表明Hys与CdS间存在较强烈的吸附效应.荧光寿命测定得¹Hys*向CdS导带传递电子的速率常数K_et分别为5.16×10⁹s^-1(HA-CdS), 5.10×10⁹s^-1(HB-CdS).以一种稳定的氮氧自由基TEMPO(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperdinyloxy)作为电子受体,当它接受一个电子和一个质子,其EPR(electron paramagnetic resonance)信号便会消失,据此,应用消自旋的EPR技术,定量研究了苝醌类光敏剂Hys与纳米半导体CdS间光生电子传递动力学,确定了受Hys光敏化作用的CdS纳米半导体表面光还原速率方程和反应动力学速率常数,结果发现,本体系中TEMPO接受电子的反应级数均为0,而不同于均相体系中的反应级数,特别是在相同可见光照射条件下,通过比较单独的CdS与Hys–CdS复合体的光还原速率常数还发现,后者的光还原效率比前者均大,约为350倍,表明Hys对CdS纳米半导体具有显著的光敏化作用.这提示在太阳能应用中,Hys是一种很有效的光敏化剂.     

距树干不同距离处华北落叶松人工林细根生物量分布特征及季节变化

 该文研究了华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)人工林细根生物量水平分布和季节变化特征。采用钻土芯法(土钻内径7.0 cm), 在距树干20、50和100 cm处设取样点, 每个样点处分3层(0~10、11~20和21~30 cm)钻取土芯, 取样时间为5、7、9和10月。华北落叶松人工林细根(≤2 mm)生物量全年平均值为224.89 g&#8226;m^–2, 在水平分布上表现为100 cm处细根生物量最大(244.20 g&#8226;m^–2), 其次为20 cm处(221.03 g&#8226;m^–2), 50 cm处最少(209.45 g&#8226;m^–2)。在0~30 cm土层, 总细根(包括活跟和死根)生物量季节变化范围在169.67~263.09 g&#8226;m^–2之间, 9月细根生物量最大, 5月细根生物量最少。0~10 cm土层细根生物量季节变化差异显著(p＜0.05), 11~20和21~30 cm差异不显著(p＞0.05)。距树干100和20 cm处(0~10 cm土层), 细根生物量的季节变化差异明显(p＜0.05), 9月总细根生物量最大(172.82和185.68 g&#8226;m^–2), 5月总细根生物量最少(69.28和73.47 g&#8226;m^–2); 50 cm处季节变化差异不明显(p＞0.05)。细根生物量分布和季节变化不仅受土壤垂直格局影响同时也与距树干不同水平距离有很大的关系。     

一个在肺癌血清中高表达的标志分子SAA的发现及鉴定

应用表面增强基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)对175例肺癌病人和43例正常人血清进行了蛋白质谱检测. 通过Biomarker Wizard&#8482; 和Biomarker Patterns&#8482;软件分析显示11.6 kD蛋白峰在肺癌病人血清中明显高于正常对照组, 同时该蛋白峰的表达水平与肺癌病人的临床分期密切相关, 随着病情的加重而逐渐升高. 进而采用Tricine-SDS-PAGE结合质谱分析鉴定出芯片上11.6 kD的蛋白峰为血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein, SAA). 使用抗SAA的特异性抗体通过免疫沉淀进一步证实了该蛋白峰为SAA. 同时还采用了ELISA方法对上述部分血清样本中SAA表达水平进行了测定, 结果显示其敏感性和特异性分别为84.1%和80%. 与蛋白质芯片使用单一差异蛋白质SAA划分结果基本一致. 上述实验结果表明, SAA能很好地划分肺癌病人和正常对照组, 很可能成为肺癌诊断和病情检测的一个标志分子.     

血红素加氧酶-1介导CD4+CD25High调节性T淋巴细胞拮抗哮喘气道炎症的实验研究

探讨血红素加氧酶-1(HO-1, heme oxygenase-1)介导CD4⁺CD25^High调节性T淋巴细胞(Treg, regulatory T cells)拮抗哮喘气道炎症的作用. 用卵清蛋白(OVA)致敏、激发小鼠制备并建立哮喘动物模型, 并在致敏、激发过程中经氯化高铁血红素(Hemin)或锡-原卟啉(SnPP, Sn- protoporphyrin)处理. 分别测定激发后各组动物血清OVA特异性IgE, 支气管肺泡灌洗液中(BALF, bronchial alveolar lavage fluid)细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS, eosinophil)数及外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞变化和肺组织HO-1和Foxp3 mRNA表达量, 结合病理切片分析气道炎症状况. 结果显示: OVA组、Hemin组、SnPP组血清OVA-特异性IgE和BALF中细胞总数及EOS数明显高于正常对照组, 但Hemin组IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数明显低于OVA组; 而OVA组和SnPP组间IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数无显著性差异; 病理组织学显示OVA组、Hemin组和SnPP组气道组织均见EOS浸润, 但Hemin组气道炎症仍明显轻于OVA组和SnPP组; Hemin组外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞比例及肺组织Foxp3 mRNA相对表达量明显高于OVA组. Hemin显著上调HO-1表达. 实验表明, 用Hemin诱导HO-1高表达后外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞比例及Foxp3 mRNA相对表达量明显升高, 同时血清OVA特异性IgE明显下降, BALF中细胞总数和EOS数减少, 气道炎症减轻; 提示HO-1可通过提高CD4⁺CD25^High Treg细胞比例并增强其功能来调节体内Th1/Th2平衡, 在支气管哮喘中起到保护作用.     

中国人肝脏细胞色素P450 2E1表达——基因型与表型的关系

细胞色素P450(CYP)2E1代谢激活多种致癌物并参与酒精代谢和自由基形成,其基因启动子区RsaⅠ单核苷酸多态与酒精性肝病和某些癌症如食管癌和肺癌的易感性相关.以免疫印迹和特异底物的方法研究了RsaⅠ识别的不同基因型肝脏标本中CYP2E1蛋白含量及其功能活性的差异.结果表明,c1/c1基因型(n=28)的蛋白含量((124.0±83.9)pmol/mg)高于携带至少一个c2等位基因的变异基因型((65.5 ± 38.9)pmol/mg,n=22),差异有极显著性(P<0.01).c1/c1基因型的肝微粒体代谢4-硝基苯酚的活性也同样显著高于变异基因型((198.4 ± 27.8)pmol/(min· mg)比 (101.2 ± 18.1)pmol/(min·mg),P <0.01)).结果证明,CYP2E1表达水平和酶活性的个体差异与RsaⅠ识别的基因多态有关,这与分子流行病学研究发现的c1/c1基因型是某些癌症的遗传易感因素一致.     

载脂蛋白B基因单体型与中国维吾尔族自然长寿的关联研究

探讨载脂蛋白B(apolipoprotein B, apoB)基因单体型与维吾尔族自然长寿之间的关系. 选择新疆和田地区191名年龄90岁以上的健康维吾尔族个体为研究对象, 另选53名年龄65~70岁、民族、性别、地域相匹配的正常个体为对照. 采用PCR-SSP (sequence specific primer), PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)和PCR-直接测序(PCR-sequencing)等技术对apoB基因第1外显子5′端信号肽插入/缺失(insertion/deletion, I/D)、第26外显子XbaⅠ限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms, XbaⅠ-RFLP)和第29外显子3′端可变数目重复序列(variable number of tandemly repeat, VNTR)进行分型. 经Logistic 回归分析显示, 长寿组apoB基因X⁺X⁺基因型频率显著高于对照组; M, L的等位基因频率和其组成的基因型频率显著增高; 在单体型分析中, 长寿组中由X⁺和M等位基因组成的单体型频率显著增高, 而由X^-和S等位基因组成的单体型频率显著降低 (均P<0.05). 研究认为: 等位基因M, L, 基因型X⁺X⁺, MM, ML, LL和单体型I-X⁺-M, X⁺-M与自然长寿显著正相关, 可能为长寿的保护因素, 而等位基因S, 基因型SS和单体型X⁺-S, D-S和 D-X⁺-S则可能是影响长寿的不利因素.     

人乳腺癌雌激素受体协调激活因子ERIAP生物学功能鉴定

雌激素受体(ER)属于核激素受体(NR)家族成员, 是一种雌激素依赖性转录因子, 在乳腺癌的发生、发展和治疗中起重要作用. 协调转录因子(协调激活因子和协调抑制因子)在ER转导激素和代谢信号到靶基因时起着关键作用. 功能和结构研究阐明, 协调激活因子通过一个和数个LXXLL基因序列(X为任意氨基酸, L为亮氨酸, 也称NR盒)与ER受体上的激受诱导活化区域相互作用. 采用酵母双杂交系统, 确定了一种与ER-α相互作用的新蛋白质ERIAP(estrogen receptor-interacting and activating protein, 雌激素受体相互作用和活化蛋白), 该蛋白质含有两个LXXLL基因序列. 通过体内免疫沉淀和体外GST捕获方法分析, 证明ERIAP以雌激素依赖性方式与ER-α相结合. ERIAP蛋白中的两个NR盒对其与ER-α相互作用是必要的. 此外, ERIAP特异性提高雌激素诱导的ER-α转录活性, 并增强雌激素响应基因pS2的表达. 研究表明, ERIAP作为一新的ER-α转录活性协调激活因子, 可能在乳腺癌的发生和发展中发挥重要的作用.     

重组腺病毒介导人肝细胞生长因子在病理性瘢痕基因治疗研究中的应用

采用细胞内质粒DNA同源重组方法, 将人肝细胞生长因子基因构建于E1, E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上, 获得携带人肝细胞生长因子基因(HGF)的重组腺病毒Ad-HGF. 在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法扩增制备Ad-HGF和Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒), 然后, 用Ad-GFP和Ad-HGF体外分别转染原代培养的兔耳瘢痕成纤维细胞, 观察体外转染效率及表达, 并以新西兰兔耳瘢痕为体内模型, 观察局部瘢痕组织中一次性注射Ad-HGF后对已形成瘢痕的治疗作用. 结果显示: (ⅰ) Ad-GFP感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后, 3 d时转染效率为(36.8 ± 14.1)%, 并持续表达20 d以上. (ⅱ) 用ELISA方法检测Ad-HGF感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后HGF的表达, 结果感染后3 d表达量约为76 ng/4.0 ´ 105细胞. (ⅲ)用兔耳瘢痕模型观察在瘢痕内注射不同剂量(8.6 ´ 10⁹, 8.6 ´ 10⁸, 8.6 ´ 10⁷, 8.6 ´ 10⁶ pfu)的Ad-HGF, 于注射后第32天肉眼可见Ad-HGF治疗组瘢痕较治疗前明显缩小、变薄, 甚至与周围皮肤在同一水平. 这一效应呈剂量依赖性: 大、中剂量组(8.6 ´ 10⁹, 8.6 ´ 10⁸ pfu)治疗前后瘢痕肥大指数的减少有统计学意义(P<0.05), 尚可见不同程度再生的丛状新生毛, 低剂量组(8.6 ´ 10⁷, 8.6 ´ 10⁶ pfu)治疗后瘢痕肥大指数有减小但无统计学意义, 对照组多数瘢痕大小无明显变化. 光学显微镜观察组织切片显示, 治疗组真皮中纤维组织明显少于对照组, 并可见毛囊及皮脂腺的存在; 天狼猩红染色显示大剂量组创口中胶原纤维薄且稀少, 而低剂量组和对照组创口中仍有丰富的大而粗的Ⅰ型胶原. (ⅳ)治疗兔体内未检测到抗HGF抗体的存在. (ⅴ) 局部应用Ad-HGF所介导的基因只在局部表达, 不累及远隔的器官和组织, 也未见任何毒副作用. 结果提示, 以腺病毒介导人肝细胞生长因子基因治疗病理性瘢痕在整形外科中具有一定的应用前景.     

新的红细胞分化相关基因EDRF1功能的初步研究

曾报道过通过功能筛选得到一个新的红细胞分化相关基因, 并命名为EDRF1(erythroid differentiation related factor 1, GenBank登录号为AF040247). 鉴于功能线索明确, 选择K562细胞作为模型细胞, 通过基因转染技术观察了EDRF1反义RNA表达和EDRF1过表达对细胞增殖和分化的影响, [³H]TdR掺入和半固体集落培养实验的结果显示EDRF1过表达时, 细胞增殖代谢能力有所下降. Northern印迹和RT-PCR的结果表明, 反义EDRF1表达载体转染后的K562细胞α-globin, γ-globin mRNA表达水平下降, STAT3, c-myc, GATA-1表达下调, 红细胞生成素受体(EpoR)在反义表达载体转染后表达有一定程度的上调. 说明EpoR和珠蛋白的表达调节没有内在的正协同关系, EDRF1对K562细胞增殖和分化的调节有可能是通过影响GATA-1等诸多红系特异的转录因子与顺式序列相互作用的转录活性实现的.     

细胞内钙动员对猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流的调节

为研究急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents, STOCs)的基本特性及其调节, 采用全细胞穿孔膜片钳技术记录STOCs的变化. 结果发现, STOCs具有明显的电压依赖性, 随机地叠加在全细胞大电导钙激活钾通道(large Ca²⁺-activated-K⁺ channels, BKCa)电流上, BKCa通道的特异性阻断剂卡律蝎毒素(charybdotoxin, ChTX) 200 nmol/L可完全抑制STOCs的活性. 逐步降低细胞外Ca²⁺浓度可明显抑制STOCs活性直至完全消失, 而钙离子载体A23187(10 μmol/L)可明显增强STOCs的活性. L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent calcium channels, L-VDCCs)阻断剂维拉帕米(20 μmol/L)和氯化镉(200 μmol/L)对STOCs的活性却没有明显影响. 兰诺定受体(ryanodine receptors, RyRs)的特异性激动剂咖啡因(5 mmol/L)能够明显激活STOCs, 而其阻断剂兰诺定(ryanodine, 50 μmol/L)却可以使其不可逆性完全抑制; 随后再应用咖啡因(5 mmol/L)不能再次激活STOCs. 三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, IP3Rs)阻断剂2APB(40 μmol/L)也可明显抑制STOCs的活性, 继而使用咖啡因(5 mmol/L)仍可激活STOCs. 结果表明: 猪冠状动脉平滑肌细胞的STOCs是由BKCa通道介导的, 细胞外Ca²⁺对于STOCs的产生是必需的, 而L-VDCCs介导的Ca²⁺内流不影响STOCs的活性, RyRs是STOCs产生的最终通路, IP₃Rs也可能参与了STOCs的调控.