牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a( )载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。     

细胞内钙动员对猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流的调节

为研究急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents, STOCs)的基本特性及其调节, 采用全细胞穿孔膜片钳技术记录STOCs的变化. 结果发现, STOCs具有明显的电压依赖性, 随机地叠加在全细胞大电导钙激活钾通道(large Ca²⁺-activated-K⁺ channels, BKCa)电流上, BKCa通道的特异性阻断剂卡律蝎毒素(charybdotoxin, ChTX) 200 nmol/L可完全抑制STOCs的活性. 逐步降低细胞外Ca²⁺浓度可明显抑制STOCs活性直至完全消失, 而钙离子载体A23187(10 μmol/L)可明显增强STOCs的活性. L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent calcium channels, L-VDCCs)阻断剂维拉帕米(20 μmol/L)和氯化镉(200 μmol/L)对STOCs的活性却没有明显影响. 兰诺定受体(ryanodine receptors, RyRs)的特异性激动剂咖啡因(5 mmol/L)能够明显激活STOCs, 而其阻断剂兰诺定(ryanodine, 50 μmol/L)却可以使其不可逆性完全抑制; 随后再应用咖啡因(5 mmol/L)不能再次激活STOCs. 三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, IP3Rs)阻断剂2APB(40 μmol/L)也可明显抑制STOCs的活性, 继而使用咖啡因(5 mmol/L)仍可激活STOCs. 结果表明: 猪冠状动脉平滑肌细胞的STOCs是由BKCa通道介导的, 细胞外Ca²⁺对于STOCs的产生是必需的, 而L-VDCCs介导的Ca²⁺内流不影响STOCs的活性, RyRs是STOCs产生的最终通路, IP₃Rs也可能参与了STOCs的调控.     

牛RHOQ基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得牛RHOQ基因cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,牛RHOQ基因的cDNA序列全长1 517 bp,包含1个618 bp开放阅读框,编码205个氨基酸;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于分泌系统囊泡;二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。牛RHOQ基因编码蛋白可能具有生长因子功能,可能在神经再生和突触延伸过程中起重要作用。     

无角牦牛体尺性状对体重影响的通径分析

旨在通过无角牦牛体尺性状对其体重作较为准确的估计,剖分牦牛各体尺性状对体重的影响。实验随机选取247头8-10月龄的无角牦牛为研究对象,其中公牛155头,母牛92头;测量各牦牛的体长、体高、胸围和管围4个体尺数据,并称量其体重;采用逐步线性回归的方法建立无角牦牛体重与体尺的多元线性回归方程;利用通径分析的方法计算各体尺性状对体重的直接作用和间接作用。结果表明,公牛的胸围和管围之间的相关系数未达到显著水平(P0.05),其他各性状之间的表型相关系数均达到了极显著水平(P0.01);公牛和母牛体重与体尺的多元线性回归方程分别为Y=-86.969+0.338X_1+1.082X_3+0.905X_4和Y=-85.693+0.440X_2+0.860X_3+1.972X_4,其中Y为体重(kg)、X_1为体高(cm)、X_2为体长(cm)、X_3为胸围(cm)、X_4为管围(cm),回归方程算得的体重估计值与体重实际观察值之间差异不显著;胸围对体重的直接作用大于其他体尺性状的直接作用,并大于其他形态性状通过胸围而影响体重的间接作用。结果提示,本研究建立的多元线性方程可应用于无角牦牛的良种选育实践,通径分析结果表明影响无角牦牛体重的主要因素来自于其胸围指标。     

小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究

为了研究 Sry 基因的调控网络,采用 siRNA 技术使 Sry 基因沉默,探讨了有效沉默 Sry 基因的途径和最佳条件. 设计、合成针对小鼠 Sry 基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer 4.1-CMV neo vector,构建以小鼠 Sry 基因为靶点的 siRNA 干涉载体 pSilencer 4.1/Sry217及 pSilencer 4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第 11.5 天,即 11.5 dpc (days post coitum,性交后天数) 取出胚胎,采用双重 PCR 法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量 RT-PCR 法检测Sry 基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对 Sry 基因表达量的影响. 研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为 9.5 dpc,注射剂量为 20 μg,注射干扰质粒 pSilencer 4.1/Sry565 对 Sry基因的抑制效率达 85% 左右. 结果表明,siRNA 可以显著抑制雄性胚胎 Sry 基因的表达.     

小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究

为了研究Sry基因的调控网络,采用siRNA技术使Sry基因沉默,探讨了有效沉默Sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠Sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠Sry基因为靶点的siRNA干涉载体pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第11.5天,即11.5dpc(dayspostcoitum,性交后天数)取出胚胎,采用双重PCR法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量RT-PCR法检测Sry基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对Sry基因表达量的影响.研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为9.5dpc,注射剂量为20μg,注射干扰质粒pSilencer4.1/Sry565对Sry基因的抑制效率达85%左右.结果表明,siRNA可以显著抑制雄性胚胎Sry基因的表达.     

牦牛HORMAD1基因的克隆及生物信息学分析

利用分子克隆技术获得了牦牛HORMAD1基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等方面进行了预测和分析.结果表明,牦牛HORMAD1基因包含一个长度为1 182 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸;其编码蛋白属于亲水性蛋白,无明显的信号肽,含有很多个磷酸化位点.二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主.HORMAD1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛HORMAD1与黄牛、马和猪等物种的HORMAD1氨基酸遗传距离较近,具有高度相似性.     

生殖激素对小鼠胚胎性别影响的研究(简报)

性别控制是人类很早就关心的研究领域,因为许多重要的经济性状与性别有直接关系。在家畜生产中,性别控制应用潜力很大,可以大幅度提高生产力,节约生产成本。性别控制可使肉用家畜多产雄性后代,乳用家畜多产雌性后代。为了达到控制