溶瘤病毒的免疫学机制及临床研究进展

溶瘤病毒（oncolytic virus,OVs）历经百年发展,应用于当前最具潜力的肿瘤免疫疗法。它主要是天然的或基因修饰的DNA病毒和RNA病毒。近年来随着基因工程技术的飞跃发展,经基因改造的溶瘤病毒在肿瘤治疗领域取得很大进展,很多不同类型的病毒（包括单纯疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和呼肠孤病毒等）正处于临床前研究、临床试验阶段或已批准上市,显示了良好的安全性和临床疗效。普遍认为溶瘤病毒靶向杀伤肿瘤细胞是通过选择性在肿瘤细胞内自我复制,最终裂解肿瘤细胞,同时可激发机体的免疫应答反应,进而增强抗肿瘤免疫效果,靶向杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显影响。运用基因重组技术将溶瘤病毒与免疫检查点相结合以及肿瘤免疫联合疗法的兴起和不断进步,使溶瘤病毒的应用更加广泛,但仍存在病毒靶向性、安全性、给药途径等瓶颈问题。本文综述了溶瘤病毒的发展史、病毒分类、不同类型溶瘤病毒产品的临床研究进展、溶瘤病毒靶向杀伤肿瘤的免疫学机制及未来发展面临的挑战与展望等。     

运用免疫蛋白质组学方法筛选羊种布鲁氏菌免疫反应性蛋白

布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,能引起人类慢性感染,造成家畜流产和不孕.在不同种布鲁氏菌中,羊种布鲁氏菌毒力最强,在中国布鲁氏菌病流行中占主导地位.目前,还没有安全的用于预防人类布鲁氏菌感染的疫苗.用于预防家畜布鲁氏菌感染的弱毒活疫苗产生的抗体能够干扰对免疫动物感染布鲁氏菌野毒的诊断,从而对根除布鲁氏菌病的计划实施有负面影响.然而,羊种布鲁氏菌免疫蛋白质谱目前还不完善.为了研制更安全、有效且能区分野毒感染的疫苗,本研究应用免疫蛋白质组学技术筛选羊种布鲁氏菌疫苗株M5的免疫反应性蛋白.经二维电泳结合免疫杂交技术筛选到88个具有免疫反应性的蛋白质点,后经质谱鉴定其归属于61个蛋白,包括许多新的免疫反应性蛋白,如延伸因子G,F0F1ATP合成酶亚单位？？,OMP1.本研究为布鲁氏菌病疫苗研制提供了许多免疫反应性候选蛋白.     

冷适应减毒B型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定

以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变．构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为：pAB121-PB1, pAB122-PB2, pAB123-PA, pAB124-HA, pAB125-NP, pAB126-NA, pAB127-M和pAB128-NS．在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B．该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/2004．rMDV-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512．实验结果暗示：从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型．     

沙柳木蠹蛾的研究

沙柳木蠹蛾Holcocerus arenicola(Staudinger)是沙柳根部一种钻蛀性害虫.亦为害踏郎、酸刺、毛乌柳、柠条等.国内分布于内蒙、新疆、宁夏、陕西、甘肃等省(区). 该虫四年1代, 以幼虫在寄主蛀道内越冬.老熟幼虫5月上旬入沙化蛹;成虫6月初开始羽化, 中旬达盛期;7月上旬幼虫初孵, 取食、为害至10月下旬越冬.成虫白天静伏于沙柳丛, 傍晚8时半至10时半活动、交配、产卵, 趋光性强.雌蛾对雄蛾性诱力较强.成虫寿命2.9—4.1天, 产卵量平均265.4粒, 性比0.67—0.68:1.     

转基因家兔模型制作方法

作为生物医学研究重要的实验动物模型,转基因家兔已经被广泛应用在人类心脑血管疾病、艾滋病以及癌症等生物医学研究领域,特别是利用转基因家兔模型在人类动脉粥样硬化实验研究中已经取得了令人注目的成绩。本文结合我们自己制作转基因家兔的经验、研究成果以及文献资料,详细介绍了利用原核显微注射法、直接将外源基因注入受精卵雄原核中的转基因家兔制作技术,回顾了利用转基因家兔模型在生物医学研究中取得的重要进展。     

A/California/07/2009亚型猪流感冷适应减毒疫苗株的拯救及免疫效果评价

应用反向遗传学技术,选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 ca (H2N2)型流感病毒的6个内部基因为骨架,与A/California/07/2009株流感病毒2个抗原基因HA、NA分别克隆到polⅠ-polⅡ转录表达载体pAD3000中,构建8个转录表达载体重组质粒,共转染Vero细胞,获得重配A/California/07/2009ca株流感病毒．重配病毒的TCID₅₀为7.5,病毒传4代后其血凝素(HA)滴度稳定在1∶256,半数感染剂量EID₅₀为8,鸡胚传20代,经RT-PCR鉴定未发现重组病毒基因突变,电镜观察重配病毒符合流感病毒的主要特征;蔗糖纯化的病毒经肌肉注射(灭活)及滴鼻(减毒活病毒)两种途径免疫BALB/c小鼠,结果显示：滴鼻免疫和肌肉注射都可以产生较高效价的血凝抑制(HI)抗体,肌肉注射组产生的HI抗体略高(P = 0.044),但肌肉注射组检测不到高效价IgA抗体;滴鼻免疫组鼻冲洗液中可以检测到高效价的IgA抗体,同型病毒感染后,IL-1β、TNFα、IFN-α等前炎因子分泌较早,且高于肌肉注射组(P < 0.05),可见,喷鼻减毒疫苗比灭活全病毒疫苗能更好地激发黏膜免疫反应．通过对小鼠各个器官病毒载量的检测发现,4天后鼻腔、气管、脑、肺、脾脏没有病毒存在,证明减毒活疫苗株在小鼠上是安全的．以上数据可以初步断定,重组病毒有作疫苗候选株的可能,而且喷鼻疫苗具有降低免疫剂量、同时激活体内体液免疫和细胞免疫的功能．     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母表达及其生物活性分析

将人可溶性晚期糖基化终产物受体(human soluble Receptor for advanced glycation end product,hsRAGE)cDNA插入巴斯德毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA,构建重组表达载体pGAPZαA-hsRAGE,并转化到毕赤酵母X-33中,利用含抗生素Zeocin的YPD平板筛选重组子。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型分泌表达,在发酵液中获得了相对分子质量约45 kD的重组蛋白。摇瓶发酵结果表明,在发酵温度30℃、pH6.0、发酵时间72 h时重组蛋白表达占发酵上清液总蛋白68.4%。Western blotting显示,重组蛋白能够被相应抗体所识别。纯化后的重组hsRAGE具有与AGEs相互结合的活性,并能够显著地抑制AGEs诱导的人血管内皮细胞系ECV-304细胞NF-κB信号通路中NF-κB/p65基因的表达。     

2006～2007年流行流感病毒减毒疫苗株的构建

选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株作为骨架病毒,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入5个氨基酸突变(PB1-391E,581G,661T,PB2-265S,NP-34G).HA和NA来源于2006-2007当年流行株A/New Caledonia/20/99(H1N1).8个基因片段通过与改造后的转录载体pAD3000连接,构建8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒:pMDV-A-PB2、pMDV-A-PB1、pMDV-A-PA、pMDV-A-NP、pMDV-A-M、pMDV-A-NS、pMDV-A-HA、pMDV-A-NA.6质粒与当年流行株的表面基因HA和NA进行"6 2"组合的病毒拯救,8个重组质粒共转染COS-1细胞,成功拯救出了具有血凝性的冷适应减毒的重组A型人流感病毒.鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价为l:279-1:210.构建的A/AA/6/60 6个内部基因的病毒骨架拯救系统,为深入研究冷适应减毒人流感病毒的基因功能和新型疫苗研发奠定了基础.