利用CRISPR-Cas9技术敲除MAS1基因的质粒构建与酶切方案优化的研究

CRISPR-CAS9技术是新一代基因编辑技术,可简便快捷地对哺乳动物细胞进行指定基因的敲除,实现沉默外源基因表达的目的。但传统的CRISPR-CAS9技术提供的酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。本实验通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,继而通过胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。研究结果说明:BbsⅠ酶与px459质粒比值为1μL:500 ng,酶切体系为50μL,酶切时间为45 min时,酶切效果最佳、胶回收率最高,且此时目的基因在细胞内的表达量为0,确定该实验条件下目的基因被成功敲除。     

蛋白激酶C在晚期糖基化终产物促进人腹膜间皮细胞分泌纤维连接蛋白中的作用

目的:观察晚期糖基化终末产物(AGEs)对人腹膜间皮细胞合成和分泌纤维连接蛋白(FN)的影响及细胞内蛋白激酶C(PKC)在其中的作用。方法:在体外制备晚期糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA),分别用不同浓度的(0,100,500,1 000μg/ml)AGE-HSA作用于人腹膜间皮细胞,用荧光实时定量PCR和ELISA方法测定人腹膜间皮细胞FN的表达;用ELISA方法观察AGEs对人腹膜间皮细胞PKC活性影响,应用PKC激活和抑制剂观察PKC在AGE-HSA促进人腹膜间皮细胞合成FN中的作用。结果:AGE-HSA呈时间剂量依赖性激活人腹膜间皮细胞中的PKC(P<0.05);AGE-HSA同时以时效和量效方式促进人腹膜间皮细胞中FN基因和蛋白的表达(P<0.05);PKC激活剂佛波酯(PMA)也能刺激人腹膜间皮细胞合成FN,先用PMA耗竭细胞内PKC或用PKC抑制剂calphostin C后,可抑制AGE-HSA诱导的FN分泌(P<0.05)。结论:AGEs可能部分通过活化PKC促进人腹膜间皮细胞合成和分泌FN,参与腹膜纤维化。     

老年肝硬化并发自发性腹膜炎临床特点及病原学分析

目的探讨老年肝硬化并发自发性腹膜炎(SBP)患者的临床特点及腹水病原菌分布及其耐药情况,指导临床合理用药。方法回顾性分析老年肝硬化并发SBP患者的临床特点,并对118例腹水病原菌培养结果阳性的120株病原菌进行鉴定和耐药分析。结果365例SPB患者治愈113例(31.0%),好转99例(27.1%),病情恶化自动出院及死亡153例(41.9%)。发病隐匿164例(44.9%),急性发病201例(55.1%)。365例SBP患者腹水病原菌培养阳性118例(32.3%),共分离出病原菌120株,其中大肠埃希菌检出率最高,占40.0%(48/120),其次为肺炎克雷伯菌,占12.5%(15/120)。分离菌株的耐药情况比较严重,特别是大肠埃希菌对多种抗菌药物的耐药率60%。结论老年肝硬化并发SBP患者病情复杂,病死率高,且细菌耐药比较严重,应尽早进行腹水培养,依据药物敏感试验结果合理选用抗菌药物。     

B.T颗粒剂生产工艺流程的研究

(一)吸附剂1.炉灰渣和黄土按照规定的要求进行烘干,粉碎、过筛20—40目2.炉灰渣和黄土之间的配比为7:3(重量比)炉灰渣和黄土按配比称重后一定要混匀.3.B·T乳液按喷雾筛孔径进行过滤,按规定的质量标准和用量(10%)向吸附剂上喷雾,一定将吸附剂和B·T乳液拌匀.(二)烘干     

己酸菌DNA中G—C含量的测定

利用核酸的增色性,采用备有加热装置的紫外分光光度计,测定了己酸菌DNA的热变性温度(Tm),得出己酸菌G-C克分子百分数含量为30.9.测定结果表明G-C含量与传统分类允许的范围一致.     

人Notch受体胞内区基因N2ICD和N3ICD克隆及真核表达体系的构建

Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体N2ICD/pEGFP和N3ICD/pEGFP,将序列正确的重组质粒转染HeLa细胞,显微镜下可见明显的绿色荧光,并定位在细胞核内。Western blotting检测目的蛋白成功融合表达,并能够提高其下游靶基因Hes1的转录活性。     

逆境胁迫下ABA与钙信号转导途径之间的相互调控机制

Ca2+信号是植物应答各种逆境胁迫响应的一个重要组分,它在植物抗病、抗虫及适应非生物胁迫反应中起着重要的作用.Caz+信号作为第二信使在激素信号转导尤其是ABA信号转导过程中发挥着重要作用.研究表明,当植物受到如干旱、低温、盐害等环境胁迫时,细胞迅速积累ABA,胞内钙离子浓度瞬间升高,然后钙离子浓度呈现忽高忽低的震荡现象.在植物细胞中发现Caz+/CDPK、Caz+/CaM和Caz+/CBL三类钙信号系统,它们与逆境胁迫信号转导密切相关.本文通过综述植物在逆境条件下,ABA与钙信号的产生、转导及产生适应性和抗性等方面,介绍了ABA与钙信号之间的相互调节机制.     

Lnc01089在肝癌细胞中的表达分析

为探讨Lnc01089与肝癌细胞侵袭的关系,本研究分析了Lnc01089在肝癌细胞株和肝癌组织中的表达情况。从肝癌细胞株HepG2、Huh7、SMMC-7721和15例成对的肝癌组织及其癌旁组织中提取总的RNA,经逆转录得到cDNA,通过qRT-PCR实验,分析Lnc01089在肝癌组织和这三种肝癌细胞株中的表达水平。结果发现Huh7、SMMC-7721中Lnc01089的表达量明显低于HepG2;肝癌组织中Lnc01089的平均表达量也明显低于癌旁组织,差异均有统计学意义(p0.05)。结果提示Lnc01089表达水平的降低与肝细胞的恶性程度有关。因此Lnc01089可能与肝癌的发生、发展有密切联系,有望为肝癌治疗提供新的靶点。     

高糖应激致人PRKCD基因过表达内皮细胞模型构建及鉴定

目的:构建高糖应激下人PRKCD基因过表达内皮细胞模型并鉴定。方法:设计含AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的PRKCD基因上下游引物,以含PRKCD基因的原始质粒为模版,PCR扩增获得PRKCD全部序列,经AgeⅠ和NheⅠ酶切后与同样酶切后的真核表达载体pDC316-LacZα重组获得穿梭质粒pDC316-PRKCD,经PCR及酶切、基因测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pB-HGlox△E1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-PRKCD,行PCR鉴定并反复纯化扩增后用TCID50法测定病毒滴度。分组培养人脐静脉内皮细胞,转染重组腺病毒后于高糖(25mmol/L)负荷,并设立空载体对照及渗透压对照组,以免疫荧光法检测PKCδ在细胞中的表达。结果:目的基因成功插入穿梭质粒,基因测序结果与GenBank公布序列一致,重组腺病毒Ad5-PRKCD经PCR鉴定及免疫荧光鉴定成功。测得病毒滴度为1.0×1010IU/ml。激光共焦聚观察高糖负荷下,胞内PRKCD翻译产物PKCδ荧光表达强度明显增强,为正常对照组的1.5倍(P0.05),高糖负荷下内皮细胞感染重组腺病毒后PKCδ荧光强度明显增加,浆/核荧光强度比值较高糖组进一步降低了35%(p0.05),提示核转位明显。结论:成功构建了人重组腺病毒Ad5-PRKCD并有效转染人脐静脉内皮细胞,高糖负荷使PKCδ表达上调并发生核转位激活,为筛选稳定表达PKCδ的内皮细胞株及其蛋白复合体奠定了基础。     

病毒入胞机制研究方法及其研究进展

多数病毒家族利用胞吞作为入侵宿主细胞的途径。胞吞既可以介导病毒内化,也可以将病毒运输到复制位点。已知的胞吞途径包括:网格蛋白依赖型内吞、小窝蛋白依赖型内吞、巨胞饮和网格蛋白、小窝蛋白非依赖型内吞。随着对胞吞过程中各组分结构和功能了解的日趋深入,研究胞吞过程以及病毒入侵过程的手段也变得更有效,特异性更高。目前,化学抑制剂的使用仍十分普遍,但该方法常非特异性地阻断细胞某些功能。一些分子抑制方法,如过表达显性负突变体和siRNA技术等,因其对单一途径的特异性阻断,使得应用分子型抑制剂逐渐取代了化学抑制剂。本文主要分析了研究病毒入侵途径时所使用的实验方法,并列举了一些实例。